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仲尼

新虫 (小有名气)

[求助] western小白求助-内参相关 已有4人参与

本人第一次做western,还在摸索中,希望有经验的虫友帮忙:
关于内参的使用方法(本人可以查到的)如下,选哪种方法更合理和保险呢,希望大神帮忙。
①同时跑两个胶,一个转膜后,用来孵育目标蛋白抗体;另一个转膜后,用来孵育内参抗体。
②跑一个胶,转膜后,先孵育目标蛋白抗体。然后,直接孵育内参抗体。
③现在有专门的抗体去除液,可以实现用同一个膜:孵育完目标蛋白抗体,并显色;用去除液去除抗体,再孵育内参抗体,显色。

注:我的目标蛋白是一种细胞膜蛋白,分子量有好多个27,43,47,67,55,117KDa;内参用的是GAPDH(37KDa)

另外,我想定性我的目标蛋白,这需要在转完膜后将膜染色,然后跟蛋白Marker对比吗?还是到发光那一步,目标条带和Marker都会跑到X光片上?
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
“我的目标蛋白是一种细胞膜蛋白,分子量有好多个27,43,47,67,55,117KDa”,你确定你的抗体能把你的目的蛋白显成marker一样?  
先做一下你的目的蛋白,看看在显影成什么模样,如果能和GAPDH分开,就是一张膜,剪开分别孵育抗体。
如果不能分开,或者你不确定你剪得好,那就是先孵育目的蛋白抗体,完了后,洗了再孵育内参。
不建议两张膜一张目的蛋白,一张内参。
7楼2014-08-18 17:17:18
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仲尼

新虫 (小有名气)

没人理我,自己顶一下自己
2楼2014-08-18 08:28:07
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zero19871029

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
仲尼: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-18 14:47:31
跑一个胶,转一个膜,转膜后根据内参的大小把相应的膜剪下来,根据你说的情况你的目的蛋白跟GADPH是能够分开的~
3楼2014-08-18 11:28:18
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景宿

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
仲尼: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-18 14:47:39
可以先敷目的蛋白,然后使用洗脱液洗去之后再孵育内参,因为一般内参都是比较容易出的,所以可以后敷
4楼2014-08-18 14:28:53
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