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1楼2014-08-14 23:57:27

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a50044758

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引用回帖:

4楼: Originally posted by bswhan at 2014-08-15 10:29:24
你好，我是用试剂盒提的基因组，之前的操作都没有换过，你说的酚仿抽提具体的操作，能详细告诉我吗...

一般用的是酚：氯仿：异丙醇为25：24：1（v/v），和提的基因组DNA等体积混合，10000转离心5min，取上清，重复一次，向上清中加入1/10体积的3M pH=5.2的醋酸钠，再加入2.5倍体积纯酒精，-20度冰冻1h，14000r/min冷冻离心10min，得到的沉淀就是你的DNA，把沉淀DNA用70%的酒精洗2遍，挥发酒精后的基因组DNA纯度就很高了！

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7楼2014-08-15 15:59:41

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a50044758

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bswhan(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-15 13:00:15

基因组不纯,因为你的Marker正常，但是基因组有拖尾，里面的蛋白，多糖没除干净，你把你的基因组用酚仿抽提几遍就好了！

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bswhan

2楼2014-08-15 01:16:17

小豆子J

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bswhan(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-15 13:00:26

之前提的没有问题，说明操作上问题不大，那就可能是菌体老化或者提取试剂出了问题，试剂的问题多数会出在菌体裂解部分。

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bswhan

3楼2014-08-15 08:57:43

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2楼: Originally posted by a50044758 at 2014-08-15 01:16:17
基因组不纯,因为你的Marker正常，但是基因组有拖尾，里面的蛋白，多糖没除干净，你把你的基因组用酚仿抽提几遍就好了！

你好，我是用试剂盒提的基因组，之前的操作都没有换过，你说的酚仿抽提具体的操作，能详细告诉我吗

4楼2014-08-15 10:29:24

bswhan

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3楼: Originally posted by 小豆子J at 2014-08-15 08:57:43
之前提的没有问题，说明操作上问题不大，那就可能是菌体老化或者提取试剂出了问题，试剂的问题多数会出在菌体裂解部分。

菌体老化，我这边用的菌应该30度培养，我37度培养的，12个小时后用的，影响会很大吗？裂解剂我用的自己配的溶菌酶，也是刚配的，问题应该不是很大。我用这次的基因组PCR产物，除了主带，还有好几个条带，之前没有这样的问题的，我应该从哪里找原因呢

5楼2014-08-15 10:32:16

happydove

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bswhan(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-15 13:00:39

你好！从图上看，点样空位置很干净，你有没有测OD値？
PCR产物有问题，引物用的是以前的吗？
你没有阳性对照，阳性对照PCR结果怎么样？

6楼2014-08-15 11:15:56

bswhan

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7楼: Originally posted by a50044758 at 2014-08-15 15:59:41
一般用的是酚：氯仿：异丙醇为25：24：1（v/v），和提的基因组DNA等体积混合，10000转离心5min，取上清，重复一次，向上清中加入1/10体积的3M pH=5.2的醋酸钠，再加入2.5倍体积纯酒精，-20度冰冻1h，14000r/min冷冻 ...

非常感谢

8楼2014-08-15 18:48:17