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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 扩出的目的带，自己跑电泳 很亮，测序时为什么总说 浓度低，取消。。
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fckgood

新虫 (初入文坛)

[求助] 扩出的目的带，自己跑电泳 很亮，测序时为什么总说 浓度低，取消。。 已有6人参与

请教各位大侠：
       我扩的基因片段，自己跑了电泳，目的条带比maker亮，送测后，说 浓度低，取消测序，于是自己将之前预留的其中一管样自己再跑电泳看，目的条带还是比较亮；于是再扩，送7个样，仅1个出来了，其他结果还是如前；第三次扩了后，说 信号弱，无信号，无条带取消。。    请教大侠，这是哪里出了问题，浓度低、信号弱、无信号、无条带取消。。分别说明不同的问题还是同一问题呀？请问该如何解决呀？  不胜感激！
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1楼 2014-08-10 09:13:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我遇到这种情况就换测序公司了，别纠结了…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-08-10 09:55:53
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by fckgood at 2014-08-10 13:58:41
阁下的意思是，可能是提的DNA有问题吗?？DNA若有问题，您说的浓度测定，应如何具体操作呀？谢谢！...

专门测定浓度的仪器，只要少量的dna就行，1ul就行，测定结果还很准确的。如果没有的话，可以用分光光度计测定吸光值然后进行换算的。
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坚持到底就是胜利！
9楼2014-08-10 15:28:49
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普通回帖

for5

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-10 10:29:29
基本是同一问题。夏天的话可能质粒会在运输途中降解。另外你提了质粒，但是可能是假阳性。可以自己酶切鉴定好去测序，亦或者自己送引物
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操蛋的XX
2楼2014-08-10 09:33:12
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fckgood(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-10 10:29:46
你是不是回收连接质粒载体送去测序的啊？
如果是这样子，那就有多个环节问题：
1 是不是回收出现了问题，你用的试剂盒回收的吗？可以在洗脱的时候洗脱两次，这样可以增加回收效率
2 连接质粒载体，不知道你用的是什么载体，不过我一般用T-easy，所以你要考虑连接载体上的环节
3 抽提质粒，不知道你用的什么方法，是试剂盒还是sol I II III，抽了质粒你可以先酶切自己验证一下
4 我觉得一般情况下，送去测序的路途上应该没有什么问题
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3楼2014-08-10 09:48:48
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主，您好，提取完DNA之后做个浓度的测定就可以说明是谁的问题了。
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坚持到底就是胜利！
5楼2014-08-10 10:59:48
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fckgood

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-08-10 09:48:48
你是不是回收连接质粒载体送去测序的啊？
如果是这样子，那就有多个环节问题：
1 是不是回收出现了问题，你用的试剂盒回收的吗？可以在洗脱的时候洗脱两次，这样可以增加回收效率
2 连接质粒载体，不知道你用的是 ...

谢谢！我送的是未纯化的呀，扩了直接送的
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6楼2014-08-10 13:53:43
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fckgood

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kuaile5420 at 2014-08-10 10:59:48
楼主，您好，提取完DNA之后做个浓度的测定就可以说明是谁的问题了。

阁下的意思是，可能是提的DNA有问题吗?？DNA若有问题，您说的浓度测定，应如何具体操作呀？谢谢！
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7楼2014-08-10 13:58:41
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ncuduhan

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by fckgood at 2014-08-10 13:53:43
谢谢！我送的是未纯化的呀，扩了直接送的...

哦哦，也就是说，你是PCR完了之后直接送去产物测序的？？？
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8楼2014-08-10 14:53:03
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470642365mm

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by fckgood at 2014-08-10 13:58:41
阁下的意思是，可能是提的DNA有问题吗?？DNA若有问题，您说的浓度测定，应如何具体操作呀？谢谢！...

要是有nanodrop 2000或2000c这台仪器，测质粒浓度，RNA浓度等就方便多了。你可以问问你们系哪个实验室有，可以借用一下啊。
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10楼2014-08-12 08:26:38
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