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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 加了酶切位点和保护碱基的引物Tm值计算及PCR问题。急急急
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北化方华

铁虫 (初入文坛)

[求助] 加了酶切位点和保护碱基的引物Tm值计算及PCR问题。急急急 已有7人参与

加了酶切位点和保护碱基后tm值增加了30度，本身引物就50度了，而且长度很短15bp左右，做过各种梯度和分布PCR，P出来的时候很少很少，加了GCbuffer或者DMSO后也没P出来，跑胶都是非特性性条带，一大条的涂带那种，现在想试下touch down，不知道用哪个Tm值设置，好忧伤。
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1楼 2014-08-04 15:12:13
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BIOTITAN2009

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-08-05 17:46:49
kpn1和xho1，加上最合适的保护碱基。就达30度了
A-F        CGGGGTACC     ATGAACGACCAAACGCAATT
A-R        CCGCTCGAG     TTAATCTAGGTCATCATCAATT
B-F        CCGCAGTACT    ATGACCACCACTGCCCAA
B-R        CCGCTCGAG      TCAAACCTTTGCG ...

AF的PCR使用温度为60.4，AR为57.7，BF为61.9，BR为63.6，使用时取各对引物F与R的平均值进行。不知道你怎么算的，怎么可能达到80度
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Ignorance is infinite.
22楼2014-08-07 14:38:41
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-04 17:09:07
北化方华: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-05 17:40:46
妹子 我支你一招 你先不加酶切位点和保护碱基去扩增，P出目的条带后，回收做模板再用加酶切位点和保护碱基的引物再扩一遍
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2014-08-04 15:44:06
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北化方华

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-04 15:44:06
妹子 我支你一招 你先不加酶切位点和保护碱基去扩增，P出目的条带后，回收做模板再用加酶切位点和保护碱基的引物再扩一遍

这样可以吗，那之后用啥温度扩增呢
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3楼2014-08-04 16:09:20
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-04 17:09:22
加入酶切位点和保护碱基之后，计算引物的Tm值时不受影响的，只计算跟模板序列结合的那段引物序列的Tm就可以了
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rainwater
4楼2014-08-04 16:09:59
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