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北化方华

铁虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 93.3
帖子: 24
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虫号: 3187710
注册: 2014-05-07
性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 加了酶切位点和保护碱基的引物Tm值计算及PCR问题。急急急已有7人参与

加了酶切位点和保护碱基后tm值增加了30度，本身引物就50度了，而且长度很短15bp左右，做过各种梯度和分布PCR，P出来的时候很少很少，加了GCbuffer或者DMSO后也没P出来，跑胶都是非特性性条带，一大条的涂带那种，现在想试下touch down，不知道用哪个Tm值设置，好忧伤。

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1楼 2014-08-04 15:12:13

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BIOTITAN2009

金虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 879.9
红花: 2
帖子: 162
在线: 100.6小时
虫号: 1809008
注册: 2012-05-10
专业: 膜生物化学与膜生物物理学

引用回帖:

16楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-08-05 17:46:49
kpn1和xho1，加上最合适的保护碱基。就达30度了
A-F CGGGGTACC    ATGAACGACCAAACGCAATT
A-R CCGCTCGAG    TTAATCTAGGTCATCATCAATT
B-F CCGCAGTACT ATGACCACCACTGCCCAA
B-R CCGCTCGAG    TCAAACCTTTGCG ...

AF的PCR使用温度为60.4，AR为57.7，BF为61.9，BR为63.6，使用时取各对引物F与R的平均值进行。不知道你怎么算的，怎么可能达到80度