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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒提取问题，都快1个月了，求解决了啊？
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清逸凌风

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒提取问题，都快1个月了，求解决了啊？ 已有4人参与

将别人给的质粒
（不知道抗性、序列，只知道里面有我需要的目的基因片段。抗性的确定我是分别把转化的感受态细胞分别涂到含有A、C、K的平板上，结果A和K的板子长了，然后转点到A+K的平板上，也长了，提取质粒。）导入DH5@中进行扩展，然后用质粒提取试剂盒提取质粒（试剂盒没有问题，实验室别人都能正常提取出来），浓度大概在100ng/ul左右。

下一步就是验证，将别人给的质粒和自己提取的质粒进行电泳验证，结果如下：

分析：明显我提取出来的质粒和别人给的质粒结果差别很大

我的问题：是否这个质粒不适宜DH5@菌株里面扩增，还有最上面的条带是什么？基因组？RNA？为什么我把纯质粒导进去，提出来成这样了，按理说质粒的转化效率还是很高的啊。


为了进一步验证我接下来有了单酶切3h两个质粒，跑胶，结果如下：
marker后Lane1:别人的质粒单酶切结果
              Lane2：自己的质粒酶切

综上：我的困惑时怎么样扩增别人的质粒，样品越来越少了，都快1个月，各种纠结啊，有没有大神也遇到这样的问题，求解决啊，金币多多的？

质粒提取问题，都快1个月了，求解决了啊？
质粒跑胶图


质粒提取问题，都快1个月了，求解决了啊？-1
酶切结果图
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1楼 2014-07-30 15:44:24
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清逸凌风

金虫 (小有名气)
自己顶，在线等，现在所有的实验都不做了，就等结果了…………………………
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2楼2014-07-30 15:47:00
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清逸凌风

金虫 (小有名气)
咋么都没有人呢？
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3楼2014-07-30 16:09:05
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xy656691

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-30 16:49:08
1，你不知道载体序列，你知道多克隆位点的序列吗？如果不知道，你做酶切时是根据什么选择的内切酶？
2，图片一中“实验室同一批次提取的质粒跑胶”，从这个图片来看质粒提取的应该不好，条带应该是单一的。
3，别人给的质粒，你就再问一次抗性，或者载体的名称吧。
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4楼2014-07-30 16:23:17
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清逸凌风

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xy656691 at 2014-07-30 16:23:17
1，你不知道载体序列，你知道多克隆位点的序列吗？如果不知道，你做酶切时是根据什么选择的内切酶？
2，图片一中“实验室同一批次提取的质粒跑胶”，从这个图片来看质粒提取的应该不好，条带应该是单一的。
3，别 ...

1.质粒上面有我要的基因，该基因的序列我是知道的，酶切位点的选择就有依据了。
2、没有酶切的质粒跑胶，出现四个条带之正常的，存在线性，开环换装和超螺旋的质粒。
3、如果别人说了抗性的话，我就不会花那么大的功夫做这些无用功的，关键给质粒的人死活不说，我也没办法，只能这样。

谢谢你的回复，真心感谢！！！！
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5楼2014-07-30 19:44:58
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用这个质粒干嘛，如果单纯是要目的基因，你可以用pcr直接p出来。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2014-07-30 20:20:15
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zkz38210098

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
清逸凌风(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-01 10:34:56
把你的目的基因从这个质粒上P出来，连接到T载体上，送测，再设计引物（含酶切位点），目的片段跟你自己实验室所用的载体进行双酶切回收后做连接转化涂板鉴定等。构建自己已知的含目的基因的质粒。
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7楼2014-07-31 12:26:26
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
清逸凌风(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-01 10:35:08
你们用试剂盒提的质粒效果都有模糊，不是很好。     
你现在的目的是为了得到你的目的片段，不是为了大批量扩增体质，因为你即使扩的再多再好，也没用。因为你不知道他两端的酶切位点，而且对你不一定用得上。
个人建议同6.7楼，赶紧设计引物扩增出来继续做你的实验，不然就真浪费时间了，不要走入了误区。
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8楼2014-07-31 15:45:31
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