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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 起始密码子放在酶切位点前
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coffee159

金虫 (小有名气)

[求助] 起始密码子放在酶切位点前 已有2人参与

想要表达一批蛋白，但这些蛋白中都没有起始密码子，而我的载体上面也没有起始密码子，所以想要对载体进行改造下，在酶切位点BamHI前面插入起始密码子ATG。不知道这样是否可行，如果这样的话就在新的蛋白中引入了3个氨基酸，对蛋白是否有影响？
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1楼 2014-07-23 20:05:27
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
coffee159: 金币+1 2014-07-23 21:35:22
你确定没有起始密码子？那它怎么表达的？
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2楼2014-07-23 21:33:29
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coffee159

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2014-07-23 21:33:29
你确定没有起始密码子？那它怎么表达的？

我要表达的是融合蛋白，前边是一段短肽，是没有起始密码子的
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3楼2014-07-23 21:35:15
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
coffee159(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:53:12
起始密码子是肯定要加的，载体上没有你就得手动加上，你在你酶切位点前面加一个ATG引入了3个AA，而你在酶切位点后面加ATG就引进一个M，你说哪个更合适？
一般用载体导致N端或者C端多了几个AA这都是不可避免的，你表达出来的叫重组蛋白又不是原始的蛋白，一般不影响的。
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大家相互帮助哈
4楼2014-07-23 22:03:07
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-07-24 11:21:41
引用回帖:
3楼: Originally posted by coffee159 at 2014-07-23 08:35:15
我要表达的是融合蛋白，前边是一段短肽，是没有起始密码子的...

你没有弄错？如果没有其实密码，那何来短肽，何来融合蛋白？
若有，你就不要加了，非要加的话也可以，但注意不要造成frame shift....
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5楼2014-07-23 22:19:25
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coffee159

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-23 22:03:07
起始密码子是肯定要加的，载体上没有你就得手动加上，你在你酶切位点前面加一个ATG引入了3个AA，而你在酶切位点后面加ATG就引进一个M，你说哪个更合适？
一般用载体导致N端或者C端多了几个AA这都是不可避免的，你表 ...

因为需要做的克隆比较多，所以就打算直接在载体的酶切位点前面加上ATG，谢谢啊
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6楼2014-07-24 12:45:32
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coffee159

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-23 22:19:25
你没有弄错？如果没有其实密码，那何来短肽，何来融合蛋白？
若有，你就不要加了，非要加的话也可以，但注意不要造成frame shift.......

有些短肽是前面没有起始密码子的。谢谢你
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7楼2014-07-24 12:46:07
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by coffee159 at 2014-07-24 12:45:32
因为需要做的克隆比较多，所以就打算直接在载体的酶切位点前面加上ATG，谢谢啊...

我记得好像EcoR1里自带个ATG如果合适的话可以直接用

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大家相互帮助哈
8楼2014-07-24 16:01:48
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