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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 重金求证论文中碰到的蛋白电泳模糊不清晰的问题, 已有5人参与

如图,我在夏天跑的蛋白电泳和冬天清晰度完全不一样,夏天的好模糊,一团团的,没有清晰边界。而冬天跑的非常清晰;

请各位分析下原因:
中间变化的因素:1)冬天用的是自制的试剂、缓冲液等,夏天用的是碧云天公司买的成套蛋白电泳试剂;
                2)冬天实验室温度在10-15度左右,夏天实验室温度25-35间;其他 诱导条件均不变
                3)个人操作冬天是新手,夏天熟练多了

各位帮忙找找原因,跪谢!!!!

谁能找到正确的答案及分析,另加金币

重金求证论文中碰到的蛋白电泳模糊不清晰的问题,
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

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2楼: Originally posted by lxj341401 at 2014-07-23 11:50:48
模糊的原因一是样品上样量太少,你看marker其实跑的结果差不多;二可能是温度导致的,可以采用恒温电泳系统解决。

上样量都是12UL左右,没有变化
无乱冬天夏天,每次电泳都是放在盛满冰水的盆子里跑的,电泳内的温度应该差别不大
4楼2014-07-23 14:51:01
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

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3楼: Originally posted by yuguiyan at 2014-07-23 12:02:14
我觉得是温度太高蛋白有部分降解了,加大上样量,然后电泳过程中加冰块或者在制冷的柜子里进行,总之要保持低温,至少也要4度啊,现在夏天这么热样品也要尽量放在冰盒上,不能像冬天那么拿来拿去!祝你顺利,有问题 ...

我在怀疑是否在诱导时就产生部分降解了,拿样品都采用冰盒放置的,至少现在好像

上样量似乎都是一样的
5楼2014-07-23 14:53:14
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

怕沉下去,自己顶顶!
6楼2014-07-23 18:18:04
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

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7楼: Originally posted by lxj341401 at 2014-07-23 22:42:26
新手都以为上样体积一样上样量就一样,除了体积跟样品中蛋白的浓度也有关系的。
...

这个我也不好掌握,因为每次都是取得1毫升菌液提取的总蛋白,然后用上样缓冲液稀释的。如果浓度稀了增加上样体积能否解决这个问题?
边界模糊一团不是降解的问题吗?
如果是降解该如何处理?
8楼2014-07-23 23:00:15
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

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9楼: Originally posted by lxj341401 at 2014-07-24 07:44:29
浓度低就增加提高体积。
容易降解的化处理后立即电泳或者冷冻保存,上样前再煮沸处理,离心取上清去电泳。

似乎这个操作没有问题
我们是把样品一个月以内放置在4度冰箱
10楼2014-07-24 08:29:12
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

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11楼: Originally posted by 冯宝宝2014 at 2014-07-24 09:17:00
我觉得原因有2个,一是上样量少,二是destain过程时间太久。但鉴于夏天做的胶图上连Marker都不是很清楚,而且背景色为紫色,所以是你褪色过程中没及时更换吸附纸,而只是长时间褪色,所以你可以试着缩短褪色时间,好 ...

脱色一般是换4-5次脱色液
没有用过吸附纸啊
12楼2014-07-24 14:06:14
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

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11楼: Originally posted by 冯宝宝2014 at 2014-07-24 09:17:00
我觉得原因有2个,一是上样量少,二是destain过程时间太久。但鉴于夏天做的胶图上连Marker都不是很清楚,而且背景色为紫色,所以是你褪色过程中没及时更换吸附纸,而只是长时间褪色,所以你可以试着缩短褪色时间,好 ...

一般脱色至少6-8个小时
13楼2014-07-24 14:06:59
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
14楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-24 17:39:19
胶没什么问题,问题在蛋白上样量,染色方面。

加量?你们这种情况一般加多少?染色缩短时间?
15楼2014-07-24 17:41:32
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

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17楼: Originally posted by 冯宝宝2014 at 2014-07-25 08:03:42
我做这部分实验室,不换脱色液,只是先前半小时左右换一次吸附纸(你可以用卫生纸放在胶上),然后每隔一个小时换一次吸附纸(大约4-6小时)或不换吸附纸过夜褪色都行,你的夏天胶图没啥问题,你不就是想知道蛋白质 ...

你们用什么做的吸附纸??我们是换脱色液的

上样量似乎关系不大吧,MARKER一直都上那么多啊,但是冬天都清楚

我要看的清楚些,至少边界清晰。

图片才能用上去
18楼2014-07-27 17:37:20
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