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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重金求证论文中碰到的蛋白电泳模糊不清晰的问题,
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 重金求证论文中碰到的蛋白电泳模糊不清晰的问题, 已有5人参与

如图，我在夏天跑的蛋白电泳和冬天清晰度完全不一样，夏天的好模糊，一团团的，没有清晰边界。而冬天跑的非常清晰；

请各位分析下原因：
中间变化的因素：1）冬天用的是自制的试剂、缓冲液等，夏天用的是碧云天公司买的成套蛋白电泳试剂；
                2）冬天实验室温度在10-15度左右，夏天实验室温度25-35间；其他 诱导条件均不变
                3）个人操作冬天是新手，夏天熟练多了

各位帮忙找找原因，跪谢！！！！

谁能找到正确的答案及分析，另加金币

重金求证论文中碰到的蛋白电泳模糊不清晰的问题,
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1楼 2014-07-23 11:42:59
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-23 12:47:40
模糊的原因一是样品上样量太少，你看marker其实跑的结果差不多；二可能是温度导致的，可以采用恒温电泳系统解决。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-07-23 11:50:48
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-23 12:47:58
我觉得是温度太高蛋白有部分降解了，加大上样量，然后电泳过程中加冰块或者在制冷的柜子里进行，总之要保持低温，至少也要4度啊，现在夏天这么热样品也要尽量放在冰盒上，不能像冬天那么拿来拿去！祝你顺利，有问题再联系！

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3楼2014-07-23 12:02:14
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2014-07-23 11:50:48
模糊的原因一是样品上样量太少，你看marker其实跑的结果差不多；二可能是温度导致的，可以采用恒温电泳系统解决。

上样量都是12UL左右，没有变化
无乱冬天夏天，每次电泳都是放在盛满冰水的盆子里跑的，电泳内的温度应该差别不大
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4楼2014-07-23 14:51:01
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuguiyan at 2014-07-23 12:02:14
我觉得是温度太高蛋白有部分降解了，加大上样量，然后电泳过程中加冰块或者在制冷的柜子里进行，总之要保持低温，至少也要4度啊，现在夏天这么热样品也要尽量放在冰盒上，不能像冬天那么拿来拿去！祝你顺利，有问题 ...

我在怀疑是否在诱导时就产生部分降解了，拿样品都采用冰盒放置的，至少现在好像

上样量似乎都是一样的
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5楼2014-07-23 14:53:14
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
怕沉下去，自己顶顶！
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6楼2014-07-23 18:18:04
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by charles08 at 2014-07-23 14:51:01
上样量都是12UL左右，没有变化
无乱冬天夏天，每次电泳都是放在盛满冰水的盆子里跑的，电泳内的温度应该差别不大...

新手都以为上样体积一样上样量就一样，除了体积跟样品中蛋白的浓度也有关系的。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2014-07-23 22:42:26
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lxj341401 at 2014-07-23 22:42:26
新手都以为上样体积一样上样量就一样，除了体积跟样品中蛋白的浓度也有关系的。
...

这个我也不好掌握，因为每次都是取得1毫升菌液提取的总蛋白，然后用上样缓冲液稀释的。如果浓度稀了增加上样体积能否解决这个问题？
边界模糊一团不是降解的问题吗？
如果是降解该如何处理？
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8楼2014-07-23 23:00:15
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
charles08(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:36:15
浓度低就增加提高体积。
容易降解的化处理后立即电泳或者冷冻保存，上样前再煮沸处理，离心取上清去电泳。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2014-07-24 07:44:29
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lxj341401 at 2014-07-24 07:44:29
浓度低就增加提高体积。
容易降解的化处理后立即电泳或者冷冻保存，上样前再煮沸处理，离心取上清去电泳。

似乎这个操作没有问题
我们是把样品一个月以内放置在4度冰箱
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10楼2014-07-24 08:29:12
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