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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做RACE老是出现非特异扩增，求助！
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青青草allan

银虫 (小有名气)

[求助] 做RACE老是出现非特异扩增，求助！ 已有3人参与

我在做RACE扩增一个基因的全长cDNA，设计的基因特异引物可以扩增出中间的重叠片段（经测序确证），但是5‘和3’RACE总是做不出来。根据已经扩增出的中间片段，设计了5‘和3’RACE引物，能扩增出条带，Maker指示的片段大小也和目的片段大小差不多，但是经切胶回收，连接转化，挑斑，送菌样测序后测回来的序列在NCBI上比对后，发现相似性较高的老是一些别的东西的序列（如某个病毒的基因组，或者是某个东西的核糖体蛋白）。也尝试换过引物，但是要么扩不出东西，要么是空载体，要么是上述那种情况。我用的是试剂盒是SMART™ RACE cDNA Amplification Kit。请有经验的高人指点，不胜感激！

[ Last edited by 西门吹雪170 on 2014-6-28 at 12:44 ]
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爱出者爱返，福往者福来
1楼 2014-06-28 11:47:38
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lma223

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
青青草allan(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-11 11:15:26
为了保障你的RACE能够特异性，请设计多条引物，有种方法叫做 Asymetric PCR with nested primer。即，先用你的specific 引物1 单引物扩增10-50个cycle，然后再用新的specific 引物2 （引物2的位置应该在引物1的上游）和5‘ 末端引物进行正常PCR扩增。 3‘引物2的位置应该在引物1 的下游，其余同上  祝好！
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知行合一，致良知！
12楼2014-07-10 17:03:05
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2014-06-28 19:50:49
你的双链做的怎么样？RNA质量好不好？特异引物设计的退火多少度？测序后能不能拼接？

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-06-28 12:07:43
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-28 12:07:43
你的双链做的怎么样？RNA质量好不好？特异引物设计的退火多少度？测序后能不能拼接？

我们实验室是统一提的RNA，做的cDNA，也有别的人在用，也有做出来别的基因的全长的，应该没有问题。避免反复冻融，我们做的5‘和3’cDNA是用小PCR分装的，一直放在-20度，现在已经放了有两个多月。我是在做5个基因的全长，特异引物设计的退火温度都不一样啊，都做出来了，有的800-1000bp的基本上测序的时候都让公司给双向测通拼接了，小于800bp的基本都是让正向测序，没有拼接过。有影响吗？谢谢回帖！
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爱出者爱返，福往者福来
3楼2014-06-30 09:09:15
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
青青草allan: 金币+1, ★有帮助 2014-07-11 21:37:04
青青草allan: 金币+1, ★有帮助 2014-07-11 21:37:52
引用回帖:
3楼: Originally posted by 青青草allan at 2014-06-30 09:09:15
我们实验室是统一提的RNA，做的cDNA，也有别的人在用，也有做出来别的基因的全长的，应该没有问题。避免反复冻融，我们做的5‘和3’cDNA是用小PCR分装的，一直放在-20度，现在已经放了有两个多月。我是在做5个基因 ...

你们的双链cDNA做的好不好？race获得的序列能否与已知片段拼接起来？

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4楼2014-06-30 09:17:05
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