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革兰氏阴性菌质粒提取已有3人参与
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我手上有一个革兰氏阴性菌，只测序过基因组，其他信息一概不知，接下来想将质粒测序，所以开始提取质粒，但是并不确定这个菌是否有质粒。 最初用的就是欧米伽的普通的质粒提取试剂盒，但是根本没有条带，同时提取了别的质粒（成功），证明试剂盒和方法操作没有问题，尝试多次都没有。 接下来开始手提，碱裂解法，下面附上方法，请大家帮忙看一下方法有没有问题，有哪些需要注意和改进的地方，谢谢！ 溶液I 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris．Cl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.0) 溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。 溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释） 1%SDS 盖紧管口，快速颠倒离心管５次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。 溶液Ⅲ 5mol/Ｌ乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上３－５分钟。 碱裂解法： １）将细菌沉淀，所得重悬于200μl用冰预冷的溶液Ｉ中，剧烈振荡。 ２）加400μl溶液Ⅱ，快速颠倒5次，以混合内容物，切勿涡旋振荡！将离心管置于冰上。 ３）加300μl用冰预冷的溶液Ⅲ ，反复颠倒数次，使之分散均匀，置于冰上3-5min。 ４）4℃12 000g离心5min，将600μl上清转移到另一离心管中。 ５）加等量酚：氯仿， 剧烈振荡混匀， 4 ℃12000g离心２分钟，将上清转移到另一良心管中。 ６）室温下加600μl遇冷异丙醇，剧烈震荡，室温下放置2min。 ７）4℃12 000g离心５min，倒掉液体，吸净！ ８）加1ml 70%乙醇，颠倒数次，12000离心2min，去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。弹合 ９）加100μl含RNase A的TE缓冲液重新溶解核酸，温和震荡，保存于-20℃。 为确保方法和操作没有问题，也同时提取了别的质粒，这次居然出现了条带，不过只有一条，天然质粒不是都应该是三条带吗？我担心这一条带可能是基因组，所以将基因组和这个可能的质粒同时跑胶，就是下图，第2,3道分别是基因组和提取的可能的质粒的条带，的确不在一条带上啊，所以就送去测序，不过也不能确定就是质粒。（忽略我这块很丑的胶=。=） 后来的测序结果就像是啪啪扇我俩大嘴巴子。。。这是结果：附件是最后一次送样的样品检测报告，因为我们不知道目标质粒的大小（质粒大小一般在1k到100k不等），一旦质粒大小达到20k以上就不能根据条带确定是质粒还是核基因组。但是根据我们后期比对的情况证明样品DNA很复杂，主要是核基因组污染也比对上一些其他质粒，所以DNA是肯定存在严重污染。 侧回来有6M大，肯定不是质粒，肯定是基因组污染，现在我很困扰，都要疯了，这个阴性菌的质粒我都提了小俩月了，结果测序结果居然这样！！我提取其它质粒都没有出现过问题，请问是我的手提方法有问题吗？还是革兰氏阴性菌的内毒素干扰了质粒提取，造成基因组污染？我已经定了一个欧米伽去内毒素质粒提取试剂盒，还没有到，如果提出来的仍然不是三条带我就呵呵了。。。。。。。。之前一直没有用去内毒素的试剂盒是因为普通的试剂盒不就是可以提阴性菌的吗，大肠就是啊，以为很简单，结果一直不停地出问题。。。。。。。 求指教。。。。。。求。。。。。。欲哭无泪。。。。。。    基因组和提取的可能质粒.JPG |
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