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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请问我的菌落PCR测序产物目的片段是什么
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追邃2015

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-12 23:13:29
建议这个样品直接提一下质粒测序吧，这个结果不是你的样品的。前后都没有通用引物序列。

恩，谢谢，你说有没有可能我设计的引物不成功，所以测序结果里没有我想要的，还有昨天问的老师，他说做菌落PCR时，引物一个是M13一个是自己设计的引物，不知道你做的时候怎么用的引物呢？
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11楼2014-06-13 06:47:47
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追邃2015

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-12 23:13:29
建议这个样品直接提一下质粒测序吧，这个结果不是你的样品的。前后都没有通用引物序列。

恩，谢谢，你说有没有可能我设计的引物不成功，所以测序结果里没有我想要的，还有昨天问的老师，他说做菌落PCR时，引物一个是M13一个是自己设计的引物，不知道你做的时候怎么用的引物呢？
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12楼2014-06-13 07:29:06
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追邃2015

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-12 23:13:29
建议这个样品直接提一下质粒测序吧，这个结果不是你的样品的。前后都没有通用引物序列。

恩，是的啊，请问质粒如何提取，有没有具体的方法啊？
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13楼2014-06-13 07:32:20
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追邃2015

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-12 23:13:29
建议这个样品直接提一下质粒测序吧，这个结果不是你的样品的。前后都没有通用引物序列。

恩，我试试
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14楼2014-06-13 09:48:44
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追邃2015

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liug268 at 2014-06-12 22:38:20
那就是结果发错人了吧，跟玉米相似度如此之高。
建议跟测序公司询问一下。当然还有可能你们的PCR产物污染了...

我送的是菌液，怎么会pcr污染呢？
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15楼2014-06-13 09:49:47
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 追邃2015 at 2014-06-13 07:32:20
恩，是的啊，请问质粒如何提取，有没有具体的方法啊？...

如果是个单独的样品就直接用提质粒试剂盒提算了。要是大提就用碱裂解法提质粒吧，网上的方法多得很。
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大家相互帮助哈
16楼2014-06-13 14:07:29
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
追邃2015(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-13 16:31:59
引用回帖:
12楼: Originally posted by 追邃2015 at 2014-06-13 07:29:06
恩，谢谢，你说有没有可能我设计的引物不成功，所以测序结果里没有我想要的，还有昨天问的老师，他说做菌落PCR时，引物一个是M13一个是自己设计的引物，不知道你做的时候怎么用的引物呢？...

1.因为你这个引物是简并引物，所以你扩增出的基因两端序列其实你还是不清楚的。所以你连上T载体需要用通用引物去验证。pmD-19T的公司测序就是用的M13R/F引物扩增的。做菌落PCR M13R/F也是可以的。你的模板是cDNA还是基因组，要克隆的序列大小知道吗？从你的测序结果看，我感觉测的还是你插入核酸的序列。先确认下测序编号是不是你的，如果送质粒测序还是这个结果的话，那你的模板再确认下吧。
2.一般如果序列比较明确的话，就不需要简并引物，直接用特异性引物扩增就好了，连上T载体也是用你克隆的引物验证就没问题了。
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追邃2015
大家相互帮助哈
17楼2014-06-13 14:54:07
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追邃2015

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
17楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-13 14:54:07
1.因为你这个引物是简并引物，所以你扩增出的基因两端序列其实你还是不清楚的。所以你连上T载体需要用通用引物去验证。pmD-19T的公司测序就是用的M13R/F引物扩增的。做菌落PCR M13R/F也是可以的。你的模板是cDNA还 ...

模版是cDNA，目的片段620bp，这是我菌落PCR的图片，其中左边Marker1000,前6个样品引物为M13，后六个样品引物是M13和我设计的简并引物，再往后2个是我之前传上去的测序结果的菌落pcr(引物M13),一直找不到原因，为什么测不出来。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。
请问我的菌落PCR测序产物目的片段是什么
PCR M13 3A-3F M13.NR1 A-F 以前结果  2014-06-13 09hr 58min.jpg
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18楼2014-06-13 15:51:50
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追邃2015

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sometimess at 2014-06-12 14:51:50
怎么在序列里面没有找到该载体的克隆位点、

那是不是我没转化进去呢？
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19楼2014-06-13 15:56:34
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追邃2015

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 追邃2015 at 2014-06-13 15:51:50
模版是cDNA，目的片段620bp，这是我菌落PCR的图片，其中左边Marker1000,前6个样品引物为M13，后六个样品引物是M13和我设计的简并引物，再往后2个是我之前传上去的测序结果的菌落pcr(引物M13),一直找不到原因，为什 ...

以上的第二个6个样品的引物是M13F-我自己设计的下游引物，另外我刚做了拿我自己的引物做菌落pcr验证，以下是图片：麻烦你帮我看看是我哪部出错了吗？这个测序都快一个月了，太烦人了，刚换了家测序公司，不知道结果怎么样呢？
请问我的菌落PCR测序产物目的片段是什么-1
菌落pcr全是自己的引物 2014-06-13 16hr 02min.jpg
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20楼2014-06-13 16:15:15
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