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追邃2015

新虫 (初入文坛)

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[求助] 请问我的菌落PCR测序产物目的片段是什么已有4人参与

请问我的菌落PCR测序产物是如下片段，用的M13引物，pMD-19 vector，因为我设计的引物是简并引物，所以序列里边找不到，想问谁知道我的目的片段怎么找，以及是什么？谢谢？
引物如下：F 5' CATSGANTGGGGTGTHAT 3'
R5' GTGRAGAATRCTCTTGWACT3'

以下是测序结果：CGATGGTAGCGCGGATCTTCAGAGATTACTGTTCTCCCGGCCTCAAATAACCCATCAATTATGATGCTGTATAAAATAGCTGAAGGCTTTATTCCCCTCTGCAGCATTTCTCTGAAAAGACTCAATCCTTCATCAATCCTTCCAATTTTACAATAGCCATTAACAAGTGTACAATACACTACAACGTTTGGTTCAATGCCAGCTGACACCATAGCATCAAATACTCTTAATGCTTTCTCCATCTTGCCAACAAGACAGTACCCATCCATCAGCATACTATACACCACAGCATCAGGATGCTGACCAGCATTTACAGTTAAGTCAAATATATTTTGTGCGTCCATTATCCTTCCCAGTTTGCAAAGGTTGTTAATTATCGAACTGAAGAAAACAATATCAAGACGCATGCCATTATTCATTATTTCCAAAATCAATTCCTTGGCTTTCAGTAAACTACCATGAGTACAAAAACCTTGAATCAGGCAATGGTATGCATATTTATCAGGTGCTACTCCTTGATCAATCATCTGATTAAATTTCTCCATAGCATCATCCATCTTACCGATTCTGCAGAGGGCAGCAATCACTGACGTATAGGTCACCACATCAGGTTTCACTCCATGGTCTCTCATTTCATTGAAGATGATCATAGCCTTATCTAGCATTCCACAGTTTGCATATGCCTTGATCAGCACACTAAAAGTATAAATGTCAGGTGCAATACCGTCACCTAGCATCAAATCGAAGAGATCTGTCATATCAACTAGACATCCTTTAGTGGCGTACCCGTTGAGCATAATTTTGTAGGAGAAAACATCAGGATTTTGGCCCTTCATTGCCATTGTGTCAAAAACATCTCTAGCTTCCTTGATTTTTCCATACTTGCAAAGGGAACCCATCAACATGTTAAAAGTAACAACATCTGGTAAGATGCTCTGTCTTCTCATTTCTTTAAATACCCTAACTGCCTCCTTCCACTGTCCTGTGGAGGAGTATCCATATATCAAGTTATTATATGTCCAGTTATTTGGCAGACACTTTATTGACATTTGTCGAAGAAAGCCTCTGCTGTCCATTGCTCTGCTTACCAGGCATGATCACAGAGCTATAGTCAACAAATCAGTGATACCCGGCTGTACATTTCTTTGAATAGATCCAATGCTTATTACGTTCACCTCCTTAGAGCGTCGATTACGTATGTAGCACCACGTTCGGGAACGAACGTTCCCCACG

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附件 1 : WU.seq

2014-06-12 13:43:17, 1.2 K

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1楼 2014-06-12 12:55:16

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
追邃2015(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-13 16:31:59

引用回帖:

12楼: Originally posted by 追邃2015 at 2014-06-13 07:29:06
恩，谢谢，你说有没有可能我设计的引物不成功，所以测序结果里没有我想要的，还有昨天问的老师，他说做菌落PCR时，引物一个是M13一个是自己设计的引物，不知道你做的时候怎么用的引物呢？...

1.因为你这个引物是简并引物，所以你扩增出的基因两端序列其实你还是不清楚的。所以你连上T载体需要用通用引物去验证。pmD-19T的公司测序就是用的M13R/F引物扩增的。做菌落PCR M13R/F也是可以的。你的模板是cDNA还是基因组，要克隆的序列大小知道吗？从你的测序结果看，我感觉测的还是你插入核酸的序列。先确认下测序编号是不是你的，如果送质粒测序还是这个结果的话，那你的模板再确认下吧。
2.一般如果序列比较明确的话，就不需要简并引物，直接用特异性引物扩增就好了，连上T载体也是用你克隆的引物验证就没问题了。