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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请问我的菌落PCR测序产物目的片段是什么
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追邃2015

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问我的菌落PCR测序产物目的片段是什么已有4人参与

请问我的菌落PCR测序产物是如下片段，用的M13引物，pMD-19 vector，因为我设计的引物是简并引物，所以序列里边找不到，想问谁知道我的目的片段怎么找，以及是什么？谢谢？
引物如下：F 5'  CATSGANTGGGGTGTHAT  3'
                 R5' GTGRAGAATRCTCTTGWACT3'


以下是测序结果：CGATGGTAGCGCGGATCTTCAGAGATTACTGTTCTCCCGGCCTCAAATAACCCATCAATTATGATGCTGTATAAAATAGCTGAAGGCTTTATTCCCCTCTGCAGCATTTCTCTGAAAAGACTCAATCCTTCATCAATCCTTCCAATTTTACAATAGCCATTAACAAGTGTACAATACACTACAACGTTTGGTTCAATGCCAGCTGACACCATAGCATCAAATACTCTTAATGCTTTCTCCATCTTGCCAACAAGACAGTACCCATCCATCAGCATACTATACACCACAGCATCAGGATGCTGACCAGCATTTACAGTTAAGTCAAATATATTTTGTGCGTCCATTATCCTTCCCAGTTTGCAAAGGTTGTTAATTATCGAACTGAAGAAAACAATATCAAGACGCATGCCATTATTCATTATTTCCAAAATCAATTCCTTGGCTTTCAGTAAACTACCATGAGTACAAAAACCTTGAATCAGGCAATGGTATGCATATTTATCAGGTGCTACTCCTTGATCAATCATCTGATTAAATTTCTCCATAGCATCATCCATCTTACCGATTCTGCAGAGGGCAGCAATCACTGACGTATAGGTCACCACATCAGGTTTCACTCCATGGTCTCTCATTTCATTGAAGATGATCATAGCCTTATCTAGCATTCCACAGTTTGCATATGCCTTGATCAGCACACTAAAAGTATAAATGTCAGGTGCAATACCGTCACCTAGCATCAAATCGAAGAGATCTGTCATATCAACTAGACATCCTTTAGTGGCGTACCCGTTGAGCATAATTTTGTAGGAGAAAACATCAGGATTTTGGCCCTTCATTGCCATTGTGTCAAAAACATCTCTAGCTTCCTTGATTTTTCCATACTTGCAAAGGGAACCCATCAACATGTTAAAAGTAACAACATCTGGTAAGATGCTCTGTCTTCTCATTTCTTTAAATACCCTAACTGCCTCCTTCCACTGTCCTGTGGAGGAGTATCCATATATCAAGTTATTATATGTCCAGTTATTTGGCAGACACTTTATTGACATTTGTCGAAGAAAGCCTCTGCTGTCCATTGCTCTGCTTACCAGGCATGATCACAGAGCTATAGTCAACAAATCAGTGATACCCGGCTGTACATTTCTTTGAATAGATCCAATGCTTATTACGTTCACCTCCTTAGAGCGTCGATTACGTATGTAGCACCACGTTCGGGAACGAACGTTCCCCACG
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1楼2014-06-12 12:55:16
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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追邃2015(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-13 16:31:32
建议这个样品直接提一下质粒测序吧，这个结果不是你的样品的。前后都没有通用引物序列。
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大家相互帮助哈
8楼2014-06-12 23:13:29
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 追邃2015 at 2014-06-13 07:32:20
恩，是的啊，请问质粒如何提取，有没有具体的方法啊？...

如果是个单独的样品就直接用提质粒试剂盒提算了。要是大提就用碱裂解法提质粒吧，网上的方法多得很。
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16楼2014-06-13 14:07:29
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
追邃2015(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-13 16:31:59
引用回帖:
12楼: Originally posted by 追邃2015 at 2014-06-13 07:29:06
恩，谢谢，你说有没有可能我设计的引物不成功，所以测序结果里没有我想要的，还有昨天问的老师，他说做菌落PCR时，引物一个是M13一个是自己设计的引物，不知道你做的时候怎么用的引物呢？...

1.因为你这个引物是简并引物，所以你扩增出的基因两端序列其实你还是不清楚的。所以你连上T载体需要用通用引物去验证。pmD-19T的公司测序就是用的M13R/F引物扩增的。做菌落PCR M13R/F也是可以的。你的模板是cDNA还是基因组，要克隆的序列大小知道吗？从你的测序结果看，我感觉测的还是你插入核酸的序列。先确认下测序编号是不是你的，如果送质粒测序还是这个结果的话，那你的模板再确认下吧。
2.一般如果序列比较明确的话，就不需要简并引物，直接用特异性引物扩增就好了，连上T载体也是用你克隆的引物验证就没问题了。
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追邃2015
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17楼2014-06-13 14:54:07
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
追邃2015: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-06-14 21:26:57
引用回帖:
18楼: Originally posted by 追邃2015 at 2014-06-13 15:51:50
模版是cDNA，目的片段620bp，这是我菌落PCR的图片，其中左边Marker1000,前6个样品引物为M13，后六个样品引物是M13和我设计的简并引物，再往后2个是我之前传上去的测序结果的菌落pcr(引物M13),一直找不到原因，为什 ...

1.LZ你现在最关键的问题是你的T载体到底连上了多大的序列。你的菌落PCR验证大小是600左右，但是送去测序的结果除去载体前后50bp也有将近1200的大小。到底是测序公司把别人的结果弄成你的了还是你的菌落PCR验证不可靠？你先和测序公司联系下，让他们仔细核对下你的样品编号，自己也可以把这次测序的转化子所含质粒提出来酶切检测大小并以质粒为模板PCR验证或者直接把质粒送测序。经过上面的验证如果连的是600那说明你的菌落PCR可靠，可以继续进行下面的实验。假如验证是1200bp那问题就多了。
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21楼2014-06-14 14:30:30
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
20楼: Originally posted by 追邃2015 at 2014-06-13 16:15:15
以上的第二个6个样品的引物是M13F-我自己设计的下游引物，另外我刚做了拿我自己的引物做菌落pcr验证，以下是图片：麻烦你帮我看看是我哪部出错了吗？这个测序都快一个月了，太烦人了，刚换了家测序公司，不知道结果 ...

你到现在总共进行了几次测序？是挑不同的转化子测序还是挑同一个反复测序？这几次的测序结果一致还是每次的结果无论序列还是大小都不一样？
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22楼2014-06-14 14:32:14
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