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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR阴性对照出条带，但是内参没有，换了一管新的引物还是有条带
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紫月清风2012

新虫 (初入文坛)
您好，我也遇到了同样的问题，想问一下您的这个问题解决了吗？您是怎样解决的？达到了您预期的效果吗？
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11楼2014-07-08 19:23:45
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lhx0611

新虫 (正式写手)
换哇哈哈的水，实验室纯水不靠谱

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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12楼2014-07-09 00:02:09
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:38:13
很可能是你的微量移液器没有过滤膜，也没有消毒棉在微量移液器的杆身与接头之间形成阻塞，导致你在使用微量移液器吸取目的cDNA样品液时形成了目的cDNA气雾胶，而且cDNA气雾胶肯定会残留在微量移液器的杆身里，这样换了吸管（“枪头”）也会有cDNA样品液污染。如此cDNA样品液会随着下次加样而进入阴性实验体系，所以阴性对照实验有目的条带出现。
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13楼2014-07-09 02:26:49
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
karuirui(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-07-09 09:33:32
楼主的实验结果即使不是由于：微量移液器没有过滤膜，也没有消毒棉在微量移液器的杆身与接头之间形成阻塞，导致你在使用微量移液器吸取目的cDNA样品液时形成了目的cDNA气雾胶，而且cDNA气雾胶肯定会残留在微量移液器的杆身里；也必定是cDNA污染了阴性对照实验体系造成的，因为其他种类的DNA扩增出来不大可能是在电泳时正好与目的DNA相同，而且多次重复出现。

阴性对照反应体系被目的cDNA样品污染，导致了不该出现的cDNA扩增带出现。
   
     这种污染的原因与解决方法：
  
   （1）在微量移液器的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花或者购买有滤膜的微量移液器，防止将目的cDNA样品吸入微量移液器内。
   （2）除了DNA聚合酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
   （3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
   （4）使用新的超纯水。
   （5）对于PCR实验室充分通风，以防止空气中残留有cDNA样品或其他DNA的气溶胶。
   （6）有条件的话，把PCR扩增实验和阴性对照实验在不同的实验室完成。

     此文内容是我根据楼主的实验想象刚刚写出来的，个人意见仅供参考。
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14楼2014-07-09 02:45:17
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
我不是大神，是一边想以便录入的，所以第一次回答只回答了可能的污染的一个原因。

个人意见，仅供参考。

看来御姐我正在写的“PCR实验的常见问题与讨论-------凌波丽 个人总结第七季”的内容也要膨胀很多了。
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karuirui
15楼2014-07-09 02:50:12
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

14楼最后一句话更正：正确表达为：“此文内容是我根据楼主的实验现象刚刚写出来的，个人意见仅供参考”，原文有误，抱歉！
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16楼2014-07-09 10:02:02
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karuirui

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
15楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-09 02:50:12
我不是大神，是一边想以便录入的，所以第一次回答只回答了可能的污染的一个原因。

个人意见，仅供参考。

看来御姐我正在写的“PCR实验的常见问题与讨论-------凌波丽 个人总结第七季”的内容也要膨胀很多 ...

谢谢！非常感谢！
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17楼2014-07-11 13:26:41
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karuirui

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 紫月清风2012 at 2014-07-08 19:23:45
您好，我也遇到了同样的问题，想问一下您的这个问题解决了吗？您是怎样解决的？达到了您预期的效果吗？

我重新设计了引物。因为我把循环圈数降到了32，阴性还是有条带，而且引物换了纯化方式重新合成后还是有，我就想可能是引物自身设计有问题吧。
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18楼2014-07-11 13:28:44
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

最后一步就只能重新设计引物，注意避免二聚体，比且要避免污染。
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19楼2014-07-11 15:02:54
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