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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 请问在细胞外面有mRNA吗？
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)

[求助] 请问在细胞外面有mRNA吗？ 已有5人参与

做了一个基因在细胞中的表达量测定，收细胞时用PBS冲洗细胞三次，并将第三次的洗脱液收集起来，然后对所收集的细胞和第三次的洗脱液提RNA，反转录后进行表达量测定，结果发现洗脱液中也有该基因的表达量，而且也不低。。。所以现在我不确定是不是细胞外也会存在mRNA呢？   请教各位了~~~谢谢大家~~~
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
1楼 2014-05-31 18:49:09
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-31 21:55:13
你那不像是细胞外液中存在mRNA。
你PBS洗了3遍，收集的是第3遍，而且还表达量不低。
我们的话，叫做H2O都P出条带了。重新实验，把能换的都换了。我们实验室就有人把酶都污染了，然后一直是H2O都P出条带。
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2楼2014-05-31 18:55:11
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-31 18:55:11
你那不像是细胞外液中存在mRNA。
你PBS洗了3遍，收集的是第3遍，而且还表达量不低。
我们的话，叫做H2O都P出条带了。重新实验，把能换的都换了。我们实验室就有人把酶都污染了，然后一直是H2O都P出条带。

我用的荧光定量测定它的表达量，测出来洗脱液中和细胞中的表达量基本就差不多，我明白你说的意思，你是说洗脱液中还有目的基因，所以就会P出条带。但是用荧光定量分析的话洗脱液中的基因含量再高他也不应该比细胞中的基因含量高吧？所以我很费解。。。
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
3楼2014-05-31 20:49:14
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BioChen

银虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-31 22:44:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaohaixie at 2014-05-31 20:49:14
我用的荧光定量测定它的表达量，测出来洗脱液中和细胞中的表达量基本就差不多，我明白你说的意思，你是说洗脱液中还有目的基因，所以就会P出条带。但是用荧光定量分析的话洗脱液中的基因含量再高他也不应该比细胞中 ...

按照你这样的流程，洗脱液里面是不太可能有mRNA。而且洗脱液反转录后，做实时定量和细胞中差不多，这就更不可能了啊。
建议你检查实验过程，是不是污染了。
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4楼2014-05-31 20:52:59
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-31 20:52:59
按照你这样的流程，洗脱液里面是不太可能有mRNA。而且洗脱液反转录后，做实时定量和细胞中差不多，这就更不可能了啊。
建议你检查实验过程，是不是污染了。...

做定量用的水和mix是新的不会有问题，因为做的是绝对的荧光定量，标准曲线很好，应该能看出引物也不会有问题。现在只剩下我的待测样品了，有没有可能是我反转录的时候就没弄好，反转录失败，全是mRNA，然后不论是细胞还是洗脱液中都含有少量的DNA，结果就使得细胞和洗脱液中的表达量一致了？
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
5楼2014-05-31 21:47:12
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anmengqu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xiaohaixie(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-01 12:58:55
你在洗涤过程中会不会存在操作不好的问题呢？洗三遍，操作不好有可能细胞已经处于脆弱状态，很容易有细胞缩起并飘起来，收集的回收液里就有细胞存在了。那就会提出RNA了不是？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2014-05-31 23:51:31
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anmengqu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

还有一种情况就是你在逆转加样时会不会被污染了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2014-06-01 00:02:33
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-01 12:59:39
有可能少量细胞被你弄破了也有可能的

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2014-06-01 00:08:37
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★
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xiaohaixie(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-01 12:59:23
细胞外没有这个吧！感觉是培养的细胞在处理前或处理过程中出现裂解！或者是污染什么的！难道内参也是一样的表达量！楼主再仔细想想试验过程，多问问做过的人！

[ 发自小木虫客户端 ]
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
9楼2014-06-01 00:37:52
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BioChen

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xiaohaixie at 2014-05-31 21:47:12
做定量用的水和mix是新的不会有问题，因为做的是绝对的荧光定量，标准曲线很好，应该能看出引物也不会有问题。现在只剩下我的待测样品了，有没有可能是我反转录的时候就没弄好，反转录失败，全是mRNA，然后不论是细 ...

出现这样的情况，只能是一步步设计实验，找到原因。比如拿你的细胞cDNA和洗脱液反转录产物为模板，做一个普通PCR，看看有没有条带。除了用你目的基因的引物，还做下内参吧
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10楼2014-06-01 06:31:36
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