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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因克隆
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

[求助] 基因克隆 已有4人参与

我需要克隆一个片段，大小是240bp左右，我要克隆这个基因的cds区去构建载体做过表达，请问设计引物的时候是不是要从起始密码子也就是5端的碱基处，然后从3端末尾处也得有引物系列，也就是说这个引物是不是要扩增大小是基因原长也就是240bp？谢谢
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1楼 2014-05-24 11:57:43
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wwlygy

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-24 12:42:50
至少要把CDS区包含，也可以大一点！但不宜大太多，几十bp以内吧！这么小估计一次PCR就完活了！

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2楼2014-05-24 12:08:18
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wwlygy

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

亲有问题再问我哦，我会这个！！！

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3楼2014-05-24 13:07:02
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-24 20:42:33
我一般也就是在起始密码子处和终止密码子处设计引物的。设计引物的时候还要考虑加kozak序列和读框的问题（跟你的载体有关）
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4楼2014-05-24 13:13:41
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红卫大兵

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wwlygy at 2014-05-24 13:07:02
亲有问题再问我哦，我会这个！！！

不过我找到的序列正好从起始密码子atg开始的，然后最后一个碱基也是外显子，所以要克隆这个基因必须要在起始和结尾设计引物？
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5楼2014-05-24 13:16:13
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红卫大兵

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wwlygy at 2014-05-24 13:07:02
亲有问题再问我哦，我会这个！！！

需要加酶切位点是不是一对引物都是在前面加上你需要的酶切位点就行？
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6楼2014-05-24 13:17:00
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wwlygy

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2014-05-24 13:17:00
需要加酶切位点是不是一对引物都是在前面加上你需要的酶切位点就行？...

对，从头到尾都包括！！在前面和后面都加啊，两个酶切位点使用的buffer要匹配(⊙o⊙)哦！

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7楼2014-05-24 13:18:39
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶切位点呢？序列本身的特性呢？
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努力打败一切
8楼2014-05-25 00:34:01
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PI4K

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
If you have the sequence and sites for your restriction enzymes. I can do it for you.

For an easy way, try infusion cloning.
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9楼2014-05-26 00:40:34
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红卫大兵

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by PI4K at 2014-05-26 00:40:34
If you have the sequence and sites for your restriction enzymes. I can do it for you.

For an easy way, try infusion cloning.

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10楼2014-05-26 10:33:21
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