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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖反应产物是什么？？
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七小艾

新虫 (小有名气)

[求助] 葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖反应产物是什么？？ 已有2人参与

如题，各位大神，求教葡萄糖脱氢酶（NADP+依赖型）催化葡萄糖反应产物是什么？文献和导师都说是葡萄糖酸，可是为嘛我做出来不是的。。。
我是用自己纯化的纯酶做的反应。
由于葡萄糖酸标准品不好买，所以买了葡萄糖酸钠的标准品，再将反应液用NaOH处理后做液相检测。
1、反应液的出峰时间和葡萄糖酸钠标准品出峰时间不一样。
2、而且在底物（葡萄糖）浓度低于葡萄糖酸钠标准品的情况下，反应液的液相峰面积却比葡萄糖酸钠标准品大得多。
有文献说葡萄糖酸会被葡萄糖酸脱氢酶进一步氧化，可是就算我的酶没有纯好，这个葡萄糖酸脱氢酶反应也是要辅酶参与的呀，而且不可能所有的葡萄糖酸都反应掉了牙。在下百思不得其解，求各位大神帮帮忙啊，再做不出来就要换课题了
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1楼 2014-05-06 21:51:41
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欧阳隐飞

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

调酸之后，液相检测，看看行不行的
没把握的哈

酶纯化一定要好的哈
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2楼2014-05-11 17:04:16
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hyw30

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

肯定是生成葡萄糖酸，不同pH值体系中则可能为钠盐或酸的形式。
需从三个方面来判断：
1.确定检测方法是否正确，标准品可加在反应液中作对照
2.酶是否正确，是否具有活性，酶活检测，可用分光法测定NADP
3.反应条件是否合适，温度、pH值、试剂、浓度等。
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创科生物-酶催化www.novocata.com
3楼2014-05-11 18:38:47
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七小艾

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hyw30 at 2014-05-11 18:38:47
肯定是生成葡萄糖酸，不同pH值体系中则可能为钠盐或酸的形式。
需从三个方面来判断：
1.确定检测方法是否正确，标准品可加在反应液中作对照
2.酶是否正确，是否具有活性，酶活检测，可用分光法测定NADP
3.反应条 ...

酶是预先测过酶活的，确定有比较高的活性。
由于NADP有点贵，所以只做了EP管小试，反应过程中没有控制过pH。
标准品加到反应液中是做什么的？看标准品还会不会出峰吗？
已经排除了缓冲液和底物出峰，现在在考虑是不是有可能是NADP出峰，不知NADP在210nm紫外检测下有没有可能出峰？
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4楼2014-05-12 14:59:35
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hyw30

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 七小艾 at 2014-05-12 14:59:35
酶是预先测过酶活的，确定有比较高的活性。
由于NADP有点贵，所以只做了EP管小试，反应过程中没有控制过pH。
标准品加到反应液中是做什么的？看标准品还会不会出峰吗？
已经排除了缓冲液和底物出峰，现在在考虑 ...

加相同量的标准品到反应液中，看出不出峰，有可能产物浓度低，信号被掩盖。NADP在210nm下检测，应该信号很弱，但浓度如果过高，也会出峰的。也许是测量方法的问题，做做空白对照。如果确实反应了，NADP会全部或部分变成NADPH。
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创科生物-酶催化www.novocata.com
5楼2014-05-21 12:44:23
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七小艾

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hyw30 at 2014-05-21 12:44:23
加相同量的标准品到反应液中，看出不出峰，有可能产物浓度低，信号被掩盖。NADP在210nm下检测，应该信号很弱，但浓度如果过高，也会出峰的。也许是测量方法的问题，做做空白对照。如果确实反应了，NADP会全部或部分 ...

谢啦~~我试过与反应体系初始的NADP浓度相同的NADP溶液去做液相检测，响应值很小，也试过NADP与标准品混合做液相检测，NADP不影响标准品出峰。
1、不过奇怪的是样品放久了，之前检测到的产物峰几乎没有了。
2、更奇怪的是我用细胞破碎液再做反应，液相结果显示产物是葡萄糖酸钠。唯一的区别是之前的反应过程中没有控制pH,直接用高温灭酶，而这次的反应过程是一直控制pH在7.0。
不知是否有可能是葡萄糖酸在高温（70℃，20min）条件下会进一步反应，而葡萄糖酸钠比较稳定？
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6楼2014-05-21 20:11:48
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