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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 求助！！！质粒转化一直不成功
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝老虎317: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-05-06 18:38:04
1、建议重新做感受态，现做现用那种，下午开始做转化。
2、可以试着多加点质粒（10ul可以试试），加完后用枪头吹匀，注意不要出吹气泡，热激后放冰上5min，注意热激的温度一定是正确的（可以用温度计验证）
3、加培养基要注意提前冰浴好培养基，有助于提高转化效率。然后，放摇床上1h，这有点复性的感觉，建议不要省略这一步
4、离心建议转速不要太大，感受态细胞很脆弱，转速大概5000-6000g，1-2min，弃部分上清，自己感觉一下涂菌的量。一般现做现用的感受态转化效率很高，不需离心就可以涂板了。
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
11楼2014-05-06 18:02:07
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蓝老虎317

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-05-06 18:02:07
1、建议重新做感受态，现做现用那种，下午开始做转化。
2、可以试着多加点质粒（10ul可以试试），加完后用枪头吹匀，注意不要出吹气泡，热激后放冰上5min，注意热激的温度一定是正确的（可以用温度计验证）
3、加 ...

看了您的回复，我有几个问题反馈一下：
1、首先我手头拥有的质粒就只有5ul，所以只能用1ul来做。
2、加LB培养基，您说的是冰浴，我做的时候是把试管里LB液体培养基在37℃预热了，这一步我是不是有问题呢？   是不是应该把试管放在冰水里，不预热，让LB液体培养基保持0℃左右？
3、我之前有离心，转速是5000rpm，1min，余下的是100ul来涂菌；其他组另一个同学，她离心是12000rpm，5min，她有成功。
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12楼2014-05-06 18:46:58
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 蓝老虎317 at 2014-05-06 18:46:58
看了您的回复，我有几个问题反馈一下：
1、首先我手头拥有的质粒就只有5ul，所以只能用1ul来做。
2、加LB培养基，您说的是冰浴，我做的时候是把试管里LB液体培养基在37℃预热了，这一步我是不是有问题呢？   是不 ...

1、你用1ul好了，但是感受态一定要做好一点
2、LB培养基要提前冰浴！！！因为你热激相当于把细胞孔隙打开，让质粒进去，然后冰浴，让细胞收缩，不让质粒出来，所以你加的培养基要冰浴过的
3、那么这个转速应该影响不大了
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
13楼2014-05-06 19:00:25
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和静清寂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝老虎317(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-09 09:22:59
感受态很脆弱，-80拿出后放在ice上冰浴融化（10min左右），将溶化后的感受态加入到和转化的质粒中，轻轻吹打均匀，ice 30min； 42°热激90s，冰上2-3min。无抗培养基摇菌一小时。5000rpm离心5min。100ul上清涂板，倒置培养
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读书使人明理明智。
14楼2014-05-06 20:31:56
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PCR-CL

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝老虎317(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-09 09:23:11
你的质粒使用哪种表达载体？
质粒是经过测序，确定读码框了吗？
感受态细胞的制备是经过钙化处理的吗？你是怎样制备细胞的？
BL21(DE3)的效率要低一些，你的转化质粒使用量是多少？
上述几个问题你先确认一下，再考虑转化的事宜。
我们实验室经常操作，成功率很高的
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15楼2014-05-06 21:20:51
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meng_xu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝老虎317 at 2014-05-06 13:03:43
还是想问一下，你指的复苏是什么意思？   我对这个复苏概念真的不是很清楚...

就是热击之后加LB或者SOC培养，一般30分钟即可
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16楼2014-05-07 03:17:13
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liuyanwisdom

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
热激的温度和时间都很关键，45度热激90秒，要精确把握好时间

[ 发自小木虫客户端 ]
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17楼2014-05-07 08:22:30
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带走云彩

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝老虎317 at 2014-05-06 13:03:43
还是想问一下，你指的复苏是什么意思？   我对这个复苏概念真的不是很清楚...

就是把转化后菌在无抗培养液中摇，使其抗性基因得到表达，但是转速不宜太高，150以下，用140就行，楼主170有点高了。
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怎知一死生为虚诞？
18楼2014-05-07 10:11:21
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concon123456

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝老虎317 at 2014-05-06 13:03:43
还是想问一下，你指的复苏是什么意思？   我对这个复苏概念真的不是很清楚...

37°振摇一小时吧，目的是为了让细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因
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19楼2014-05-07 16:53:25
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瓶儿水青

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝老虎317(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-09 09:23:37
除了热击、复苏和涂板，其他操作都应该在冰上进行，如果质粒没问题的话，怀疑你抗生素浓度太高或者用错了，不会是穿梭表达载体抗性选择错了吧，希望你搞清楚，不要嫌我小看人，有时候我们都会忽略些细节

[ 发自小木虫客户端 ]
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20楼2014-05-09 00:49:47
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