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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
蓝老虎317: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-05-06 18:38:04
1、建议重新做感受态,现做现用那种,下午开始做转化。
2、可以试着多加点质粒(10ul可以试试),加完后用枪头吹匀,注意不要出吹气泡,热激后放冰上5min,注意热激的温度一定是正确的(可以用温度计验证)
3、加培养基要注意提前冰浴好培养基,有助于提高转化效率。然后,放摇床上1h,这有点复性的感觉,建议不要省略这一步
4、离心建议转速不要太大,感受态细胞很脆弱,转速大概5000-6000g,1-2min,弃部分上清,自己感觉一下涂菌的量。一般现做现用的感受态转化效率很高,不需离心就可以涂板了。
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
11楼2014-05-06 18:02:07
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蓝老虎317

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-05-06 18:02:07
1、建议重新做感受态,现做现用那种,下午开始做转化。
2、可以试着多加点质粒(10ul可以试试),加完后用枪头吹匀,注意不要出吹气泡,热激后放冰上5min,注意热激的温度一定是正确的(可以用温度计验证)
3、加 ...

看了您的回复,我有几个问题反馈一下:
1、首先我手头拥有的质粒就只有5ul,所以只能用1ul来做。
2、加LB培养基,您说的是冰浴,我做的时候是把试管里LB液体培养基在37℃预热了,这一步我是不是有问题呢?   是不是应该把试管放在冰水里,不预热,让LB液体培养基保持0℃左右?
3、我之前有离心,转速是5000rpm,1min,余下的是100ul来涂菌;其他组另一个同学,她离心是12000rpm,5min,她有成功。
12楼2014-05-06 18:46:58
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 蓝老虎317 at 2014-05-06 18:46:58
看了您的回复,我有几个问题反馈一下:
1、首先我手头拥有的质粒就只有5ul,所以只能用1ul来做。
2、加LB培养基,您说的是冰浴,我做的时候是把试管里LB液体培养基在37℃预热了,这一步我是不是有问题呢?   是不 ...

1、你用1ul好了,但是感受态一定要做好一点
2、LB培养基要提前冰浴!!!因为你热激相当于把细胞孔隙打开,让质粒进去,然后冰浴,让细胞收缩,不让质粒出来,所以你加的培养基要冰浴过的
3、那么这个转速应该影响不大了
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
13楼2014-05-06 19:00:25
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和静清寂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
蓝老虎317(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-09 09:22:59
感受态很脆弱,-80拿出后放在ice上冰浴融化(10min左右),将溶化后的感受态加入到和转化的质粒中,轻轻吹打均匀,ice 30min; 42°热激90s,冰上2-3min。无抗培养基摇菌一小时。5000rpm离心5min。100ul上清涂板,倒置培养
读书使人明理明智。
14楼2014-05-06 20:31:56
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PCR-CL

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
蓝老虎317(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-09 09:23:11
你的质粒使用哪种表达载体?
质粒是经过测序,确定读码框了吗?
感受态细胞的制备是经过钙化处理的吗?你是怎样制备细胞的?
BL21(DE3)的效率要低一些,你的转化质粒使用量是多少?
上述几个问题你先确认一下,再考虑转化的事宜。
我们实验室经常操作,成功率很高的
15楼2014-05-06 21:20:51
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝老虎317 at 2014-05-06 13:03:43
还是想问一下,你指的复苏是什么意思?   我对这个复苏概念真的不是很清楚...

就是热击之后加LB或者SOC培养,一般30分钟即可
16楼2014-05-07 03:17:13
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liuyanwisdom

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
热激的温度和时间都很关键,45度热激90秒,要精确把握好时间

[ 发自小木虫客户端 ]
17楼2014-05-07 08:22:30
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带走云彩

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝老虎317 at 2014-05-06 13:03:43
还是想问一下,你指的复苏是什么意思?   我对这个复苏概念真的不是很清楚...

就是把转化后菌在无抗培养液中摇,使其抗性基因得到表达,但是转速不宜太高,150以下,用140就行,楼主170有点高了。
怎知一死生为虚诞?
18楼2014-05-07 10:11:21
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concon123456

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝老虎317 at 2014-05-06 13:03:43
还是想问一下,你指的复苏是什么意思?   我对这个复苏概念真的不是很清楚...

37°振摇一小时吧,目的是为了让细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因
19楼2014-05-07 16:53:25
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瓶儿水青

新虫 (初入文坛)

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感谢参与,应助指数 +1
蓝老虎317(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-09 09:23:37
除了热击、复苏和涂板,其他操作都应该在冰上进行,如果质粒没问题的话,怀疑你抗生素浓度太高或者用错了,不会是穿梭表达载体抗性选择错了吧,希望你搞清楚,不要嫌我小看人,有时候我们都会忽略些细节

[ 发自小木虫客户端 ]
20楼2014-05-09 00:49:47
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