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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒酶切
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sonhey

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒酶切 已有5人参与

请问怎样保证质粒酶切彻底，如果不彻底，那又该如何检测。新手求助    谢谢
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且行且珍惜
1楼 2014-05-05 12:32:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-05 15:56:20
参见百度文库文章 ：分​子​生​物​学​中​的​基​因​克​隆​操​作​的​基​本​技​巧​之​一​：​精​确​计​算​限​制​性​内​切​酶​的​用​量
http://wenku.baidu.com/view/1b0ea0d608a1284ac85043ef.html
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3楼2014-05-05 13:52:41
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普通回帖

BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-05 15:56:10
仔细阅读内切酶的说明书，按照说明书上的反应体系酶切，一般是没有问题的。质粒不要加太多，我做克隆质粒一般切0.2微克。
切开的质粒和没有切开的质粒琼脂糖凝胶电泳能看出差别。
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2楼2014-05-05 12:40:02
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-05 15:56:36
如果单纯是摸索条件，可以分时间段取出3-5ul跑电泳，切没切开一目了然，一般参照说明书的就没有问题了
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只有不断地失败才会成功
4楼2014-05-05 14:15:16
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
少切点质粒就好，酶切产物做个转化就知道了

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2014-05-05 16:39:31
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sonhey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-05 12:40:02
仔细阅读内切酶的说明书，按照说明书上的反应体系酶切，一般是没有问题的。质粒不要加太多，我做克隆质粒一般切0.2微克。
切开的质粒和没有切开的质粒琼脂糖凝胶电泳能看出差别。

我的想法是这样的
1、如果是平端加入去磷酸化酶，尽量避免
2、做转化，然后培养提取质粒跑胶，并与原质粒作对比，即1是marker 2原质粒3提取质粒 跑胶作对比，然后对所验证正确的进行胶回收，不知道这样行吗
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且行且珍惜
6楼2014-05-05 17:57:20
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sonhey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zep616745243 at 2014-05-05 14:15:16
如果单纯是摸索条件，可以分时间段取出3-5ul跑电泳，切没切开一目了然，一般参照说明书的就没有问题了

我感觉总是会有切不彻底的，那样的话该怎样避免呢
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且行且珍惜
7楼2014-05-05 17:58:42
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sonhey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by panda73 at 2014-05-05 13:52:41
参见百度文库文章 ：分​子​生​物​学​中​的​基​因​克​隆​操​作​的​基​本​技​巧​之​一​ ...

你好   我对day1的第一步有点不解，望指点。PCR过后不就是咱们的目的基因吗，胶回收以后为什么还做一下酶切呢，做酶切是不是来增加他的末端（平末端或粘性末端）。谢谢回答
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且行且珍惜
8楼2014-05-05 18:43:33
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zep616745243

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sonhey at 2014-05-05 17:58:42
我感觉总是会有切不彻底的，那样的话该怎样避免呢...

要避免的话，可以考虑降低质粒的量，或者延长酶切时间，个人感觉takara的quickcut酶还是不错的，切得很彻底，我用双酶切产物做转化，都不会长菌
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只有不断地失败才会成功
9楼2014-05-05 19:26:02
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶切彻底不彻底，先跑胶看看，然后再通过连接转化做对照，没有什么其他特别的办法吧

当然可以演唱酶切时间，提高酶／DNA比，这样也可以保证高切割率
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10楼2014-05-06 04:58:05
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