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sonhey

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒酶切 已有5人参与

请问怎样保证质粒酶切彻底,如果不彻底,那又该如何检测。新手求助    谢谢
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-05 15:56:20
参见百度文库文章 :分​子​生​物​学​中​的​基​因​克​隆​操​作​的​基​本​技​巧​之​一​:​精​确​计​算​限​制​性​内​切​酶​的​用​量
http://wenku.baidu.com/view/1b0ea0d608a1284ac85043ef.html
3楼2014-05-05 13:52:41
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普通回帖

BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-05 15:56:10
仔细阅读内切酶的说明书,按照说明书上的反应体系酶切,一般是没有问题的。质粒不要加太多,我做克隆质粒一般切0.2微克。
切开的质粒和没有切开的质粒琼脂糖凝胶电泳能看出差别。
2楼2014-05-05 12:40:02
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-05 15:56:36
如果单纯是摸索条件,可以分时间段取出3-5ul跑电泳,切没切开一目了然,一般参照说明书的就没有问题了
只有不断地失败才会成功
4楼2014-05-05 14:15:16
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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少切点质粒就好,酶切产物做个转化就知道了

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-05-05 16:39:31
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sonhey

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-05 12:40:02
仔细阅读内切酶的说明书,按照说明书上的反应体系酶切,一般是没有问题的。质粒不要加太多,我做克隆质粒一般切0.2微克。
切开的质粒和没有切开的质粒琼脂糖凝胶电泳能看出差别。

我的想法是这样的
1、如果是平端加入去磷酸化酶,尽量避免
2、做转化,然后培养提取质粒跑胶,并与原质粒作对比,即1是marker 2原质粒3提取质粒 跑胶作对比,然后对所验证正确的进行胶回收,不知道这样行吗
且行且珍惜
6楼2014-05-05 17:57:20
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sonhey

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zep616745243 at 2014-05-05 14:15:16
如果单纯是摸索条件,可以分时间段取出3-5ul跑电泳,切没切开一目了然,一般参照说明书的就没有问题了

我感觉总是会有切不彻底的,那样的话该怎样避免呢
且行且珍惜
7楼2014-05-05 17:58:42
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sonhey

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by panda73 at 2014-05-05 13:52:41
参见百度文库文章 :分​子​生​物​学​中​的​基​因​克​隆​操​作​的​基​本​技​巧​之​一​ ...

你好   我对day1的第一步有点不解,望指点。PCR过后不就是咱们的目的基因吗,胶回收以后为什么还做一下酶切呢,做酶切是不是来增加他的末端(平末端或粘性末端)。谢谢回答
且行且珍惜
8楼2014-05-05 18:43:33
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zep616745243

银虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by sonhey at 2014-05-05 17:58:42
我感觉总是会有切不彻底的,那样的话该怎样避免呢...

要避免的话,可以考虑降低质粒的量,或者延长酶切时间,个人感觉takara的quickcut酶还是不错的,切得很彻底,我用双酶切产物做转化,都不会长菌
只有不断地失败才会成功
9楼2014-05-05 19:26:02
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
酶切彻底不彻底,先跑胶看看,然后再通过连接转化做对照,没有什么其他特别的办法吧

当然可以演唱酶切时间,提高酶/DNA比,这样也可以保证高切割率
10楼2014-05-06 04:58:05
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