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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒酶切
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sonhey

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒酶切 已有5人参与

请问怎样保证质粒酶切彻底，如果不彻底，那又该如何检测。新手求助    谢谢
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且行且珍惜
1楼 2014-05-05 12:32:43
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sonhey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-05 12:40:02
仔细阅读内切酶的说明书，按照说明书上的反应体系酶切，一般是没有问题的。质粒不要加太多，我做克隆质粒一般切0.2微克。
切开的质粒和没有切开的质粒琼脂糖凝胶电泳能看出差别。

我的想法是这样的
1、如果是平端加入去磷酸化酶，尽量避免
2、做转化，然后培养提取质粒跑胶，并与原质粒作对比，即1是marker 2原质粒3提取质粒 跑胶作对比，然后对所验证正确的进行胶回收，不知道这样行吗
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且行且珍惜
6楼2014-05-05 17:57:20
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-05 15:56:10
仔细阅读内切酶的说明书，按照说明书上的反应体系酶切，一般是没有问题的。质粒不要加太多，我做克隆质粒一般切0.2微克。
切开的质粒和没有切开的质粒琼脂糖凝胶电泳能看出差别。
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2楼2014-05-05 12:40:02
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-05 15:56:20
参见百度文库文章 ：分​子​生​物​学​中​的​基​因​克​隆​操​作​的​基​本​技​巧​之​一​：​精​确​计​算​限​制​性​内​切​酶​的​用​量
http://wenku.baidu.com/view/1b0ea0d608a1284ac85043ef.html
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3楼2014-05-05 13:52:41
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-05 15:56:36
如果单纯是摸索条件，可以分时间段取出3-5ul跑电泳，切没切开一目了然，一般参照说明书的就没有问题了
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只有不断地失败才会成功
4楼2014-05-05 14:15:16
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