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meng_xu

铜虫 (小有名气)

[求助] E coli pTet 系统表达蛋白 已有1人参与

请问各位,在用pTet系统表达的时候,四环素的浓度都是多少?我用的是1ng/ml,诱导在30度过夜,但是对照质粒的RFP表达似乎比较弱,菌液颜色没有变化。

用arabinose诱导的时候,对照质粒RFP表达就可以看见菌液颜色明显变化。

两个对照质粒除了启动子意外,其他序列(RBS,酶切等)完全相同,而且对照质粒是从addgene买的。

我个人表达做的少,不明白什么道理,请各位赐教!不胜感激!
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jinying1123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
meng_xu(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:54:44
你的意思是想说,两种表达系统差别不大,arabinose表达的好,而四环素系统表达不好,觉得不是四环素系统出现问题,而是诱导浓度选取不当,是这个意思么?那多加几个梯度浓度试试呢?

我有个疑问,四环素诱导系统addgene买的质粒那种都是带TetR和启动子就能构建这个系统了,抗性筛选不见得是四环素,可能是其他类型的抗生素,那这系统加四环素,菌为啥不死呢?
4楼2014-08-29 10:29:19
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

我是说的不够清除,抱歉

实验是这样的,对照质粒,2个,一个是四环素诱导,一个是arabinose诱导,表达的都是RFP。

我要表达的蛋白,分别克隆在这俩启动子表达系统里。

诱导后,可以看到arabinose的对照菌液变得很红,而四环素诱导的对照没有颜色变化,我不知道是不是四环素诱导的浓度不够 (1ng/ul)还是其他原因?

有人建议用aTc诱导,代替四环素,不知道谁用过?

多谢
3楼2014-04-30 04:45:33
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