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[求助]
提蛋白遇到瓶颈了，实验没法继续，各位大侠帮帮忙，一起找一下原因，有考染和银染图 已有1人参与
最近提蛋白，考染后目的条带范围内（20KD-50KD）一直没有条带，怀疑有降解，但PMSF才买不久，用的时候也很注意，但就是结果不得。我提蛋白的基本步骤是：
1、吸去培养液，然后静置一会儿使残余培养液流到瓶底后再用移液器将其吸走。
2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS，平放轻轻摇动洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液，将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液（RIPA强，碧云天）加10 μl PMSF（100mM）的比例，配好裂解液摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
4、每瓶细胞加400μl 含PMSF的裂解液，先于冰上裂解10min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5、用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后冰上继续裂解20min,然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行）
6、超声三次，每次持续10S。（注意控制功率在20%--30%之间）
7、于4℃下12000rpm离心10min。（提前开离心机预冷）。
8、将离心后的上清分装转移到1.5ml的离心管中放于－80℃保存
求助各位大侠帮忙分析分析，找找原因。 |
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