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简单的执着

银虫 (小有名气)

[求助] 大家认为判断引物设计合理的主要依据有哪些 已有3人参与

如题，不知道大家是怎么判断自己设计出来的引物合适不合适的
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1楼 2014-04-21 22:37:53
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ottoKING

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
简单的执着(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-22 13:29:06
blast查特异性、退火温度，GC含量，还有就是引物二聚体什么的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-04-21 22:49:23
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简单的执着

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ottoKING at 2014-04-21 22:49:23
blast查特异性、退火温度，GC含量，还有就是引物二聚体什么的

如果进行RT-PCR后显示扩增曲线挺不错的，溶解曲线是单峰，这能不能说明引物设计合理呀
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3楼2014-04-21 23:16:08
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j134104

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
简单的执着(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-04-22 13:29:31
引用回帖:
3楼: Originally posted by 简单的执着 at 2014-04-21 23:16:08
如果进行RT-PCR后显示扩增曲线挺不错的，溶解曲线是单峰，这能不能说明引物设计合理呀...

一般可以。但是有时候存在非特异性扩增出现的溶解曲线也是单峰，所以最好同时跑一个凝胶电泳，看是不是单一条带。 还有另一种情况，比如端粒引物这种的容易形成二聚体，并且二聚体可以扩增，也会形成单一溶解曲线同时扩增曲线很漂亮。这种情况下可以加一个空白对照
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4楼2014-04-21 23:38:28
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简单的执着

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by j134104 at 2014-04-21 23:38:28
一般可以。但是有时候存在非特异性扩增出现的溶解曲线也是单峰，所以最好同时跑一个凝胶电泳，看是不是单一条带。 还有另一种情况，比如端粒引物这种的容易形成二聚体，并且二聚体可以扩增，也会形成单一溶解曲线同 ...

请问你们在进行实验时是通过哪些条件来判断引物设计是否合理的
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5楼2014-04-22 22:12:58
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by 简单的执着 at 2014-04-21 23:16:08
如果进行RT-PCR后显示扩增曲线挺不错的，溶解曲线是单峰，这能不能说明引物设计合理呀...

“如果进行RT-PCR后显示扩增曲线挺不错的，溶解曲线是单峰”
这说明引物的特异性很好，但不能完全说明引物设计合理，还要看引物的扩增效率，做Realtime用标准曲线来检测引物的扩增效率

判断引物是否合理：
从设计角度来看，引物Tm值，GC含量，长度，二聚体形成满足一定的条件，但最终需要实践的检验，如果是做普通的基因克隆，基因型鉴定之类的，能扩增出条带就说明引物设计合理

但如果是做real time PCR，引物是否合理从下面两个方面判断：
1. 引物扩增的特异性--溶解曲线单峰
2. 引物的扩增效率--标准曲线判断 90%--110%可以接受
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2014-04-22 23:06:41
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简单的执着

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2014-04-22 23:06:41
“如果进行RT-PCR后显示扩增曲线挺不错的，溶解曲线是单峰”
这说明引物的特异性很好，但不能完全说明引物设计合理，还要看引物的扩增效率，做Realtime用标准曲线来检测引物的扩增效率

判断引物是否合理：
从 ...

我最近都感觉有点纳闷，我们做出来扩增曲线挺不错的，溶解曲线也是单峰，标准曲线可能是由于加样的时候有误差不好太，然后老师就说引物设计的不合理，让重新设计引物，我想请问一下除了上面两点之外，还有没有其他判断条件？
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7楼2014-04-23 22:10:22
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 简单的执着 at 2014-04-23 22:10:22
我最近都感觉有点纳闷，我们做出来扩增曲线挺不错的，溶解曲线也是单峰，标准曲线可能是由于加样的时候有误差不好太，然后老师就说引物设计的不合理，让重新设计引物，我想请问一下除了上面两点之外，还有没有其他 ...

realtime引物：
1. 产物长度长度控制在80-200bp之内
2. 引物最好是跨内含子设计
3. 符合一般引物设计要求
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2014-04-23 23:41:24
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