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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 大家认为判断引物设计合理的主要依据有哪些
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简单的执着

银虫 (小有名气)

[求助] 大家认为判断引物设计合理的主要依据有哪些 已有3人参与

如题，不知道大家是怎么判断自己设计出来的引物合适不合适的
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1楼 2014-04-21 22:37:53
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gyesang

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【答案】应助回帖

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引用回帖:
3楼: Originally posted by 简单的执着 at 2014-04-21 23:16:08
如果进行RT-PCR后显示扩增曲线挺不错的，溶解曲线是单峰，这能不能说明引物设计合理呀...

“如果进行RT-PCR后显示扩增曲线挺不错的，溶解曲线是单峰”
这说明引物的特异性很好，但不能完全说明引物设计合理，还要看引物的扩增效率，做Realtime用标准曲线来检测引物的扩增效率

判断引物是否合理：
从设计角度来看，引物Tm值，GC含量，长度，二聚体形成满足一定的条件，但最终需要实践的检验，如果是做普通的基因克隆，基因型鉴定之类的，能扩增出条带就说明引物设计合理

但如果是做real time PCR，引物是否合理从下面两个方面判断：
1. 引物扩增的特异性--溶解曲线单峰
2. 引物的扩增效率--标准曲线判断 90%--110%可以接受
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6楼2014-04-22 23:06:41
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ottoKING

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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简单的执着(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-22 13:29:06
blast查特异性、退火温度，GC含量，还有就是引物二聚体什么的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-04-21 22:49:23
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简单的执着

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ottoKING at 2014-04-21 22:49:23
blast查特异性、退火温度，GC含量，还有就是引物二聚体什么的

如果进行RT-PCR后显示扩增曲线挺不错的，溶解曲线是单峰，这能不能说明引物设计合理呀
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3楼2014-04-21 23:16:08
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j134104

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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简单的执着(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-04-22 13:29:31
引用回帖:
3楼: Originally posted by 简单的执着 at 2014-04-21 23:16:08
如果进行RT-PCR后显示扩增曲线挺不错的，溶解曲线是单峰，这能不能说明引物设计合理呀...

一般可以。但是有时候存在非特异性扩增出现的溶解曲线也是单峰，所以最好同时跑一个凝胶电泳，看是不是单一条带。 还有另一种情况，比如端粒引物这种的容易形成二聚体，并且二聚体可以扩增，也会形成单一溶解曲线同时扩增曲线很漂亮。这种情况下可以加一个空白对照
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4楼2014-04-21 23:38:28
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