24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 812  |  回复: 12
当前主题已经存档。
【有奖交流】积极回复本帖子,参与交流,就有机会分得作者 model031 的 1 个金币

model031

银虫 (正式写手)

[交流] 从质粒扩片段为什么扩不出来?

我设计了一对引物,在两端加了两个酶切位点,与摸板配对的序列有18个,加上酶切位点和保护碱基一共27个.配对那部分序列的Tm值很低正 反向分别有43 和39左右,请问我退火温度设到多少合适啊!
回复此楼

» 猜你喜欢

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

退火温度低点了,40℃试试吧
细推物理须行乐。
2楼2008-03-04 20:20:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

model031

银虫 (正式写手)

这样会不会有很多非特意性的条带啊,我准备设个浓度剃度从42到53不知道行不行 我们实验室有个PCR仪可以设剃度
3楼2008-03-04 20:38:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

totoro一家亲

铜虫 (小有名气)

举例说明,上游引物Tm是45度、下游50度。那么退火应该是45-5=40度。
但是40度确实很低,你可以考虑设置touch down PCR
不要太过于在意非特异性的带,你要首先P得出来再优化
如果实在不行,把你要得带做个胶回收也行呀
4楼2008-03-05 16:52:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

annwt

木虫 (正式写手)

退火温度太低了!你是用什么计算的?不过从质粒上扩应该怎样都出,谁叫模板好!
如果是我,我不加保护碱基,由于PCR产物酶切后的长度变化不大,无法通过电泳判断是否切开,对后续试验的结果判断造成困难。加了也没有关系,也可以连载体再切,也许麻烦,但是成功率高。
5楼2008-03-05 18:07:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

model031

银虫 (正式写手)

快崩溃了!

昨天又扩了一次,温度从38到44度,非特异性的条带很亮,很多.目的条带还是没有,由于我扩的是基因的全长片段,一个1300多,一个1700多,设计引物时在两端分别加了Sma1和Sac1的酶切位点,互补序列是18个碱基,这部分和酶切的6个碱机都是固定的,能改变的就是保护性碱基,不过计算退火温度不是只算互补序列的Tm值吗?我又怀疑是引物出错了,让公司重新合成了一次,不过2对引物都出错的几率还是很小的啊,不知道是不是我设计的问题?可很多碱基都不能动啊,真的不知道怎么办了?
6楼2008-03-10 09:49:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

annwt

木虫 (正式写手)

我的分析:
1,有杂带说明PCR体系没有问题,Taq和buffer、dNTP没有问题。
2、没有目的条带,并且温度已经足够低时,说明模板和引物这方面出了问题,如果可以排除模板没有问题,引物可以找同学看看,有时,人有思维定势,其他同学也许就一下指出问题。比如你的引物设计所依据的序列来源及正确性等问题,最后就是引物涉及问题。
7楼2008-03-10 15:36:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

model031

银虫 (正式写手)

你分析的很对,估计原因就在你说的第二条,不是引物就是模板,我准备用另外一对引物扩下试试,要是扩出来了,那就只能是引物有问题了,要重新设计才好。
非常感谢你的帮助!
8楼2008-03-10 16:17:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

anlewo7777

木虫 (正式写手)

可以找个酶切位点将质粒切开之后再做模板,或是在质粒提取时故意条件恶劣些使质粒不完整。我也遇到过类似问题,试一下吧
9楼2008-03-10 17:11:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

把配对的序列延长,引物退货温度跟酶切位点等附加序列无关
10楼2008-03-10 17:55:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 model031 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 291求调剂 +4 Y-cap 2026-03-29 4/200 2026-03-29 10:16 by lbsjt
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +6 崔wj 2026-03-26 6/300 2026-03-29 01:11 by hanserlol
[考研] 学硕274求调剂 +9 Li李鱼 2026-03-26 9/450 2026-03-28 21:42 by bymhappy
[考研] 一志愿北京工业大学,324分求调剂 +4 零八# 2026-03-28 4/200 2026-03-28 15:01 by 17865157980
[考研] 283求调剂 +7 A child 2026-03-28 7/350 2026-03-28 12:05 by zllcz
[考研] 277跪求调剂 +5 1915668 2026-03-27 9/450 2026-03-28 09:58 by zhshch
[考研] 085405 考的11408求各位老师带走 +3 Qiu学ing 2026-03-28 3/150 2026-03-28 09:19 by 乐呵呵的追梦人
[考研] 张芳铭-中国农业大学-环境工程专硕-298 +4 手机用户 2026-03-26 4/200 2026-03-28 07:17 by mmm just
[考研] 一志愿211院校 344分 东北农业大学生物学学硕,求调剂 +5 丶风雪夜归人丶 2026-03-26 8/400 2026-03-27 19:22 by 丶风雪夜归人丶
[考研] 化学调剂 +4 爱吃番茄的旭 2026-03-24 5/250 2026-03-27 17:50 by kiokin
[考研] 考研调剂 +10 呼呼?~+123456 2026-03-24 10/500 2026-03-27 11:46 by wangjy2002
[考研] 336材料求调剂 +7 陈滢莹 2026-03-26 9/450 2026-03-27 00:20 by wxiongid
[考研] 327求调剂 +7 prayer13 2026-03-23 7/350 2026-03-26 20:48 by 不吃魚的貓
[考研] 334分 一志愿武理 材料求调剂 +4 李李不服输 2026-03-26 4/200 2026-03-26 16:00 by 不吃魚的貓
[考研] 281求调剂 +6 Koxui 2026-03-24 7/350 2026-03-26 15:37 by 无际的草原
[考研] 打过很多竞赛,085406控制工程300分,求调剂 +3 askeladz 2026-03-26 3/150 2026-03-26 09:08 by 给你你注意休息
[考研] 332求调剂 +6 032500 2026-03-25 6/300 2026-03-25 22:45 by 418490947
[考研] 考研一志愿苏州大学初始315(英一)求调剂 +3 sbdksD 2026-03-24 4/200 2026-03-25 18:16 by xcjcqu
[考研] 335求调剂 +4 yuyu宇 2026-03-23 5/250 2026-03-23 23:49 by Txy@872106
[考研] 070300,一志愿北航320求调剂 +3 Jerry0216 2026-03-22 5/250 2026-03-23 09:16 by 。。堂堂
信息提示
请填处理意见