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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 从质粒扩片段为什么扩不出来?
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model031

银虫 (正式写手)

[交流] 从质粒扩片段为什么扩不出来?

我设计了一对引物,在两端加了两个酶切位点,与摸板配对的序列有18个,加上酶切位点和保护碱基一共27个.配对那部分序列的Tm值很低正 反向分别有43 和39左右,请问我退火温度设到多少合适啊!
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1楼 2008-03-04 20:07:21
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
退火温度低点了，40℃试试吧
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细推物理须行乐。
2楼2008-03-04 20:20:59
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model031

银虫 (正式写手)
这样会不会有很多非特意性的条带啊,我准备设个浓度剃度从42到53不知道行不行 我们实验室有个PCR仪可以设剃度
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3楼2008-03-04 20:38:38
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)
举例说明，上游引物Tm是45度、下游50度。那么退火应该是45-5＝40度。
但是40度确实很低，你可以考虑设置touch down PCR
不要太过于在意非特异性的带，你要首先P得出来再优化
如果实在不行，把你要得带做个胶回收也行呀
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4楼2008-03-05 16:52:16
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annwt

木虫 (正式写手)
退火温度太低了！你是用什么计算的?不过从质粒上扩应该怎样都出，谁叫模板好！
如果是我，我不加保护碱基，由于PCR产物酶切后的长度变化不大，无法通过电泳判断是否切开，对后续试验的结果判断造成困难。加了也没有关系，也可以连载体再切，也许麻烦，但是成功率高。
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5楼2008-03-05 18:07:43
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model031

银虫 (正式写手)

快崩溃了!

昨天又扩了一次,温度从38到44度,非特异性的条带很亮,很多.目的条带还是没有,由于我扩的是基因的全长片段,一个1300多,一个1700多,设计引物时在两端分别加了Sma1和Sac1的酶切位点,互补序列是18个碱基,这部分和酶切的6个碱机都是固定的,能改变的就是保护性碱基,不过计算退火温度不是只算互补序列的Tm值吗?我又怀疑是引物出错了,让公司重新合成了一次,不过2对引物都出错的几率还是很小的啊,不知道是不是我设计的问题?可很多碱基都不能动啊,真的不知道怎么办了?
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6楼2008-03-10 09:49:46
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annwt

木虫 (正式写手)
我的分析：
1，有杂带说明PCR体系没有问题，Taq和buffer、dNTP没有问题。
2、没有目的条带，并且温度已经足够低时，说明模板和引物这方面出了问题，如果可以排除模板没有问题，引物可以找同学看看，有时，人有思维定势，其他同学也许就一下指出问题。比如你的引物设计所依据的序列来源及正确性等问题，最后就是引物涉及问题。
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7楼2008-03-10 15:36:17
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model031

银虫 (正式写手)
你分析的很对，估计原因就在你说的第二条，不是引物就是模板，我准备用另外一对引物扩下试试，要是扩出来了，那就只能是引物有问题了，要重新设计才好。
非常感谢你的帮助！
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8楼2008-03-10 16:17:28
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anlewo7777

木虫 (正式写手)
可以找个酶切位点将质粒切开之后再做模板，或是在质粒提取时故意条件恶劣些使质粒不完整。我也遇到过类似问题，试一下吧
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9楼2008-03-10 17:11:53
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
把配对的序列延长,引物退货温度跟酶切位点等附加序列无关
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10楼2008-03-10 17:55:18
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