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model031

银虫 (正式写手)

[交流] 从质粒扩片段为什么扩不出来?

我设计了一对引物,在两端加了两个酶切位点,与摸板配对的序列有18个,加上酶切位点和保护碱基一共27个.配对那部分序列的Tm值很低正 反向分别有43 和39左右,请问我退火温度设到多少合适啊!
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annwt

木虫 (正式写手)

我的分析:
1,有杂带说明PCR体系没有问题,Taq和buffer、dNTP没有问题。
2、没有目的条带,并且温度已经足够低时,说明模板和引物这方面出了问题,如果可以排除模板没有问题,引物可以找同学看看,有时,人有思维定势,其他同学也许就一下指出问题。比如你的引物设计所依据的序列来源及正确性等问题,最后就是引物涉及问题。
7楼2008-03-10 15:36:17
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

退火温度低点了,40℃试试吧
细推物理须行乐。
2楼2008-03-04 20:20:59
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model031

银虫 (正式写手)

这样会不会有很多非特意性的条带啊,我准备设个浓度剃度从42到53不知道行不行 我们实验室有个PCR仪可以设剃度
3楼2008-03-04 20:38:38
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)

举例说明,上游引物Tm是45度、下游50度。那么退火应该是45-5=40度。
但是40度确实很低,你可以考虑设置touch down PCR
不要太过于在意非特异性的带,你要首先P得出来再优化
如果实在不行,把你要得带做个胶回收也行呀
4楼2008-03-05 16:52:16
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