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model031

银虫 (正式写手)

[交流] 从质粒扩片段为什么扩不出来?

我设计了一对引物,在两端加了两个酶切位点,与摸板配对的序列有18个,加上酶切位点和保护碱基一共27个.配对那部分序列的Tm值很低正 反向分别有43 和39左右,请问我退火温度设到多少合适啊!
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

退火温度低点了,40℃试试吧
细推物理须行乐。
2楼2008-03-04 20:20:59
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model031

银虫 (正式写手)

这样会不会有很多非特意性的条带啊,我准备设个浓度剃度从42到53不知道行不行 我们实验室有个PCR仪可以设剃度
3楼2008-03-04 20:38:38
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)

举例说明,上游引物Tm是45度、下游50度。那么退火应该是45-5=40度。
但是40度确实很低,你可以考虑设置touch down PCR
不要太过于在意非特异性的带,你要首先P得出来再优化
如果实在不行,把你要得带做个胶回收也行呀
4楼2008-03-05 16:52:16
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annwt

木虫 (正式写手)

退火温度太低了!你是用什么计算的?不过从质粒上扩应该怎样都出,谁叫模板好!
如果是我,我不加保护碱基,由于PCR产物酶切后的长度变化不大,无法通过电泳判断是否切开,对后续试验的结果判断造成困难。加了也没有关系,也可以连载体再切,也许麻烦,但是成功率高。
5楼2008-03-05 18:07:43
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model031

银虫 (正式写手)

快崩溃了!

昨天又扩了一次,温度从38到44度,非特异性的条带很亮,很多.目的条带还是没有,由于我扩的是基因的全长片段,一个1300多,一个1700多,设计引物时在两端分别加了Sma1和Sac1的酶切位点,互补序列是18个碱基,这部分和酶切的6个碱机都是固定的,能改变的就是保护性碱基,不过计算退火温度不是只算互补序列的Tm值吗?我又怀疑是引物出错了,让公司重新合成了一次,不过2对引物都出错的几率还是很小的啊,不知道是不是我设计的问题?可很多碱基都不能动啊,真的不知道怎么办了?
6楼2008-03-10 09:49:46
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annwt

木虫 (正式写手)

我的分析:
1,有杂带说明PCR体系没有问题,Taq和buffer、dNTP没有问题。
2、没有目的条带,并且温度已经足够低时,说明模板和引物这方面出了问题,如果可以排除模板没有问题,引物可以找同学看看,有时,人有思维定势,其他同学也许就一下指出问题。比如你的引物设计所依据的序列来源及正确性等问题,最后就是引物涉及问题。
7楼2008-03-10 15:36:17
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model031

银虫 (正式写手)

你分析的很对,估计原因就在你说的第二条,不是引物就是模板,我准备用另外一对引物扩下试试,要是扩出来了,那就只能是引物有问题了,要重新设计才好。
非常感谢你的帮助!
8楼2008-03-10 16:17:28
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

可以找个酶切位点将质粒切开之后再做模板,或是在质粒提取时故意条件恶劣些使质粒不完整。我也遇到过类似问题,试一下吧
9楼2008-03-10 17:11:53
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

把配对的序列延长,引物退货温度跟酶切位点等附加序列无关
10楼2008-03-10 17:55:18
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