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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » digest 之后dna消失，找不到原因了，求助
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swingsinsky

[交流] digest 之后dna消失，找不到原因了，求助

after double digesting with Bamh and NdeI all my dna was gone
1. BSA(10) 3ul, buffer 3 3ul, dH2O 12 ul, DNA 5ul, Bamh 1ul, NdeI 1ul
2. BSA(10) 3ul, buffer 2 3ul, dH2O 12 ul, DNA 5ul, Bamh 1ul, NdeI 1ul
3. BSA(10) 3ul, buffer 3 3ul, dH2O 12 ul, DNA 5ul
4. BSA(10) 1ul, buffer 6 1ul, dH2O 6.5 ul, DNA 2ul, Bamh 0.5ul, NdeI 0.5ul

37C, 1h

after running the gel, I can only find band in 3, which is the control

it's really hard for me to figure it out, because I already changed the amount in 4, and changed different buffers,
and I reduced the digestion time to 1h, so what happened to my DNA? I really need help here. Many thanks!!

plus, I added the BSA buffer and ddwater first, DNA second, and added the enzyme at last
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1楼 2008-02-29 09:50:25
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wangjun0457

银虫 (小有名气)
貌似某种限制酶被DNA水解酶污染。分别用你的BamHI和NdeI单切后找找原因。
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2楼2008-02-29 10:50:27
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swingsinsky

楼上的意思我没有领会
我的RE如果被污染了对dna有影响吗？我看不到任何dna的条带。。。
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3楼2008-02-29 11:07:15
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wangjiasi

木虫 (正式写手)
会不会是酶切后的片断太小了，当成杂带了？
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4楼2008-02-29 12:08:39
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hejiayang

★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie,
可能DNA浓度低，而你用的酶量太大，以致DNA酶切成小片段，加上你电泳时间过长，所以什么都看不到了
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5楼2008-02-29 12:19:50
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swingsinsky

电泳时间40min
我的dna长1000bps大概
理论上两边各切10bps
请问楼上酶量大为什么会把我的dna切成小片段？
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6楼2008-02-29 13:19:19
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sofu

金虫 (正式写手)
没作作阴性对照吧，即加底物，水和bsa。酶用水代替。
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"An expert is a man who has made all the mistakes which can be made, in a very narrow field." -- Niels Henrik David Bohr
7楼2008-02-29 13:25:10
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sofu

金虫 (正式写手)
★
swingsinsky(金币+1,VIP+0):thanks
也作下阳性对照，用铁定能切的dna作底物，看看酶有没有问题。
咱们都不太作阳性、隐性对照。所以出问题就比较麻烦
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"An expert is a man who has made all the mistakes which can be made, in a very narrow field." -- Niels Henrik David Bohr
8楼2008-02-29 13:27:15
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swingsinsky

回答楼楼上
3号是negative control
回答楼上
我做过positive control 切的我的vector
没有问题
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9楼2008-02-29 13:51:07
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
换酶，换管子，加大DNA量。就这么几个影响因素，就不信搞不定。
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金币是赌出来的
10楼2008-02-29 14:42:08
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