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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

★ ★
swingsinsky(金币+2,VIP+0):thanks
如果你的酶在你基因的中间没有酶切位点,你的buffer配比正确,按我下边的体系切一下试试!!
BSA(10) 2ul, buffer 2 2ul, dH2O 4ul, DNA 8ul, Bamh 1ul, NdeI 1ul

实验中一些意想不到的原因也能使你看不到亮带,紫外灯的功率,透光板是否干净,
golden view的染色效果不如EB

我个人认为你实验看不到亮带的最主要原因是DNA量太少了,不过建议你把Bamh I换了,这个酶的酶切效率太低了,Nde I我没用过

另外在设计引物的时候一定要多设计几个保护碱基!!
11楼2008-03-01 20:18:15
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annwt

木虫 (正式写手)

我觉得出现问题应该作阴、阳对照,好找原因,另外,作对照我的建议是混样,分装,再加酶,因为只有这样可以排除操作和小概率事件。
12楼2008-03-01 21:22:19
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zhufy

铁虫 (初入文坛)

我觉得是你经酶切后使DNA浓度降得太低以致电泳检测不出来,我建议加大酶切反应体系DNA量再试试
13楼2008-03-01 21:50:06
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)

BamHI和NdeI的最适反应缓冲液成份不太一样,所以不太合适做双酶切。
你用的哪家的酶?是NEB的吗?如果是,那么应该用buffer U for BamHI才对。
如果你用错了buffer,对酶的酶切活性是有影响的,可能造成star active等,会降解你的DNA。

另外,楼上面曾说的污染也是很重要的一个问题,要保证你的体系没有污染其他的酶等,不会影响你的酶切效果。
14楼2008-03-02 12:29:08
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swingsinsky

我用的invitrogen的酶
我查过手册 buffer3和buffer6对我的两个RE都是100%

现在就是只要两个酶放一起就不行
只用一种酶都能看到band
但是第二次再切的时候band就又消失了

。。。
15楼2008-03-02 23:56:46
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)

你用第一种酶做了酶切后没有纯化,做第二种,就降解了?
那你有没有做一个对照,证实你得第二种酶本身没有问题?

那实在不行就分两步做了,纯化后再切,虽然最终的得率会少些,总比都讲解了好呀
16楼2008-03-03 10:02:54
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)

建议分两个体系,两种酶分别单酶切,然后用第二种酶再切.体系加大
17楼2008-03-03 12:55:58
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