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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » digest 之后dna消失，找不到原因了，求助
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
swingsinsky(金币+2,VIP+0):thanks
如果你的酶在你基因的中间没有酶切位点，你的buffer配比正确，按我下边的体系切一下试试！！
BSA(10) 2ul, buffer 2 2ul, dH2O 4ul, DNA 8ul, Bamh 1ul, NdeI 1ul

实验中一些意想不到的原因也能使你看不到亮带，紫外灯的功率，透光板是否干净，
golden view的染色效果不如EB

我个人认为你实验看不到亮带的最主要原因是DNA量太少了，不过建议你把Bamh I换了，这个酶的酶切效率太低了，Nde I我没用过

另外在设计引物的时候一定要多设计几个保护碱基！！
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11楼2008-03-01 20:18:15
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annwt

木虫 (正式写手)
我觉得出现问题应该作阴、阳对照，好找原因，另外，作对照我的建议是混样，分装，再加酶，因为只有这样可以排除操作和小概率事件。
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12楼2008-03-01 21:22:19
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zhufy

铁虫 (初入文坛)
我觉得是你经酶切后使DNA浓度降得太低以致电泳检测不出来，我建议加大酶切反应体系DNA量再试试
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13楼2008-03-01 21:50:06
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)
BamHI和NdeI的最适反应缓冲液成份不太一样，所以不太合适做双酶切。
你用的哪家的酶？是NEB的吗？如果是，那么应该用buffer U for BamHI才对。
如果你用错了buffer，对酶的酶切活性是有影响的，可能造成star active等，会降解你的DNA。

另外，楼上面曾说的污染也是很重要的一个问题，要保证你的体系没有污染其他的酶等，不会影响你的酶切效果。
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14楼2008-03-02 12:29:08
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swingsinsky

我用的invitrogen的酶
我查过手册 buffer3和buffer6对我的两个RE都是100%

现在就是只要两个酶放一起就不行
只用一种酶都能看到band
但是第二次再切的时候band就又消失了

。。。
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15楼2008-03-02 23:56:46
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)
你用第一种酶做了酶切后没有纯化，做第二种，就降解了？
那你有没有做一个对照，证实你得第二种酶本身没有问题？

那实在不行就分两步做了，纯化后再切，虽然最终的得率会少些，总比都讲解了好呀
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16楼2008-03-03 10:02:54
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
建议分两个体系，两种酶分别单酶切，然后用第二种酶再切．体系加大
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17楼2008-03-03 12:55:58
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