各位大神，求助：PCR产物纯化后没有条带了…… - 分子生物 - PCR相关

流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。

11楼2014-04-05 15:01:59

西门吹雪170

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5楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-05 12:32:32
1 是说往柱子里面加样的时候，要悬空滴在柱子中间？这个确实没有注意到…… 汗一个
2 上样量大概多少合适？我只上了三微升，是不是太少了？3微升是因为p好的产物孔里只加这么少...

上样量在20uL左右吧，一般点完就剩很少了的，而且一般回收之后都不用检测，检测的话只是自己不相信自己

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12楼2014-04-05 15:28:57

樊樊

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12楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-04-05 15:28:57
上样量在20uL左右吧，一般点完就剩很少了的，而且一般回收之后都不用检测，检测的话只是自己不相信自己

...

因为回收完做的是TA克隆连接，所以也就想着验证一下

13楼2014-04-05 17:29:15

西门吹雪170

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13楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-05 17:29:15
因为回收完做的是TA克隆连接，所以也就想着验证一下...

没把握就验证把

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14楼2014-04-05 18:10:40

探花花

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6楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-05 12:33:21
怎么浓缩？洗脱柱子的时候少加点洗脱液吗？我是按照说明书来的……...

浓缩可以使真空冷冻干燥

相信什么才会得到什么

15楼2014-04-08 18:46:26

樊樊

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15楼: Originally posted by 探花花 at 2014-04-08 18:46:26
浓缩可以使真空冷冻干燥...

今天又纯化了两个样品，不仅仅是没有条带，纯化后产物点样的时候，和上样液完全上漂出来了。只点上样液的话就会下沉。点PCR产物也会下沉。所以，现在不仅仅是没有条带问题了……我是完全按照试剂盒说明说来操作的，为了挥发掉WB里面的乙醇，我室温分别放置了20分钟，1个小时。。。。。。怎么办

16楼2014-04-08 19:22:55

樊樊

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3楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-04-05 10:57:03
1、可能你过柱子的时候没把水加到正中间
2、你检测时的上样量太小，本来回收后浓度就很低的

你提的注意事项我特意注意了，可是，今天又纯化了两个样品，不仅仅是没有条带，纯化后产物点样的时候，和上样液完全上漂出来了。只点上样液的话就会下沉。点PCR产物也会下沉。所以，现在不仅仅是没有条带问题了……我是完全按照试剂盒说明说来操作的，为了挥发掉WB里面的乙醇，我室温分别放置了20分钟，1个小时。。。。。。什么原因这是

17楼2014-04-08 19:27:36

樊樊

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7楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2014-04-05 13:47:30
3微升的样品实在是太少了，妹子，下次别省样品。

今天点了6微升
今天又纯化了两个样品，不仅仅是没有条带，纯化后产物点样的时候，和上样液完全上漂出来了。只点上样液的话就会下沉。点PCR产物也会下沉。所以，现在不仅仅是没有条带问题了……我是完全按照试剂盒说明说来操作的，为了挥发掉WB里面的乙醇，我室温分别放置了20分钟，1个小时。。。。。。怎么办

18楼2014-04-08 19:28:11

西门吹雪170

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17楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-08 19:27:36
你提的注意事项我特意注意了，可是，今天又纯化了两个样品，不仅仅是没有条带，纯化后产物点样的时候，和上样液完全上漂出来了。只点上样液的话就会下沉。点PCR产物也会下沉。所以，现在不仅仅是没有条带问题了…… ...

你最后的是不是用水洗脱的？你确定自己的Loading buffer没有问题了吗？在最后一部洗脱前要空离的，你有做吗？

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19楼2014-04-08 19:37:17

电魂

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你不会试剂盒的洗脱液没加无水乙醇吧。

20楼2014-04-08 21:40:37