各位大神，求助：PCR产物纯化后没有条带了…… - 分子生物 - PCR相关

21楼2014-04-08 21:48:03

樊樊

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19楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-04-08 19:37:17
你最后的是不是用水洗脱的？你确定自己的Loading buffer没有问题了吗？在最后一部洗脱前要空离的，你有做吗？...

用的试剂盒里面的EB，buffer没问题，只点6*的buffer完全不上漂，我还调整了样品与buffer的比例，依旧上漂。洗脱前10000转空离了2min，为防止乙醇挥发不干净还分别放置了0.5 1小时。电泳缓冲液也是换了新鲜的。我去，我的手是不是被诅咒了？

22楼2014-04-09 15:34:40

樊樊

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20楼: Originally posted by 电魂 at 2014-04-08 21:40:37
你不会试剂盒的洗脱液没加无水乙醇吧。

我肯定加了，这样的错误不会犯得

23楼2014-04-09 15:35:23

lairongpeng

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13楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-05 17:29:15
因为回收完做的是TA克隆连接，所以也就想着验证一下...

浓度太低，可能电泳跑不出来。测一下浓度，直接连T载体，明天做转化，后天挑单克隆，摇菌pcr验证。菌液pcr有就ok。前面不用太纠结。

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24楼2014-04-09 15:39:58

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22楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-09 15:34:40
用的试剂盒里面的EB，buffer没问题，只点6*的buffer完全不上漂，我还调整了样品与buffer的比例，依旧上漂。洗脱前10000转空离了2min，为防止乙醇挥发不干净还分别放置了0.5 1小时。电泳缓冲液也是换了新鲜的。我 ...

最后我们是用水来洗脱的，我感觉你这一定哪里出问题了，让专家解答一下吧@ biostar2009

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25楼2014-04-09 18:32:21

樊樊

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25楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-04-09 18:32:21
最后我们是用水来洗脱的，我感觉你这一定哪里出问题了，让专家解答一下吧@ biostar2009...

太感谢你的耐心了，我今天又一次纯化一个，换了别人的试剂盒，别人的buffer，依旧不太行，好一点点的地方就是好像能够微微看到一点点条带，但是很模糊。不知道什么缘故，跑的胶前半部分一整片都是淡淡的荧光色，问实验室老师也是不懂。
实验室成像系统坏掉了，无图无真相。

26楼2014-04-09 23:51:28

樊樊

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25楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-04-09 18:32:21
最后我们是用水来洗脱的，我感觉你这一定哪里出问题了，让专家解答一下吧@ biostar2009...

用ddh2o洗脱的么？要不要调节ph？调节的话会不会引入离子会干扰后期的连接，酶切之类的？

27楼2014-04-09 23:52:43

樊樊

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24楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-09 15:39:58
浓度太低，可能电泳跑不出来。测一下浓度，直接连T载体，明天做转化，后天挑单克隆，摇菌pcr验证。菌液pcr有就ok。前面不用太纠结。
...

嗯，我今天就是死马当活马医了，转化，LB平板培养，现在已经12小时了但是上面才微微出现一点点的半透明菌落，上面一点点蓝斑都没有……估计是没有成功，算了，回宿舍睡觉了

28楼2014-04-09 23:54:50

lairongpeng

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28楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-09 23:54:50
嗯，我今天就是死马当活马医了，转化，LB平板培养，现在已经12小时了但是上面才微微出现一点点的半透明菌落，上面一点点蓝斑都没有……估计是没有成功，算了，回宿舍睡觉了...

连t载体的话，胶回收后，我都不跑电泳，测个浓度直接连接转化，因为连t载体是非常简单，转化效率很高的。

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29楼2014-04-10 00:02:36

yudaoqian88

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看样子楼主是对PCR产物进行检测了，产物没有问题，有目标条带，浓度大，还有平行实验！那就是回收出了问题！看看试剂中各液是否沉淀变质，再看看操作过程中是否加错了东西！一切要按照操作说明来，上述虫友说的一些细节只会影影响变量，但不至于一点没有！如果操作无误，估计就是这个盒子有问题，建议楼主用别人的纯化！别花费大量时间找原因！

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！

30楼2014-04-10 00:58:44