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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 加蛋白loading buffer后溶液呈黄色而不是蓝色,是怎么回事儿?
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biosun1988

新虫 (初入文坛)

[求助] 加蛋白loading buffer后溶液呈黄色而不是蓝色,是怎么回事儿? 已有2人参与

提取细胞蛋白做western, 抗体IP后加蛋白loading buffer,结果溶液呈现黄色.input加buffer后是正常的蓝色.这样是否可以继续电泳,或者有什么办法可以调回蓝色.
另外,在-20C冻存后有的样品变成蓝色,拿出来煮沸后全部变成黄色,请问各位大侠这是怎么回事儿.
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1楼 2014-03-25 18:29:31
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
biosun1988: 金币+5, ★★★很有帮助, 解释了问题的原因,很有帮助. 2014-03-25 20:51:25
你的样品太酸了
溴酚蓝在pH低于3时会变黄
检查一下你样品的buffer
如果就只能这样，一定要用pH 6.8的Tris把pH调回来，溴酚蓝在大于4.6的时候就是蓝色的了，所以你可能需要多加一点Tirs。
不然的话，不连续SDS-PAGE浓缩分离完全依赖于pH，可能有影响。
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2楼2014-03-25 19:30:09
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biosun1988

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-25 19:30:09
你的样品太酸了
溴酚蓝在pH低于3时会变黄
检查一下你样品的buffer
如果就只能这样，一定要用pH 6.8的Tris把pH调回来，溴酚蓝在大于4.6的时候就是蓝色的了，所以你可能需要多加一点Tirs。
不然的话，不连续SDS-P ...

我buffer就是常用的RIPA,以前没有遇到这种问题.
我先直接跑了电泳,发现上样后颜色变为蓝色了,是不是没影响了?
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3楼2014-03-25 20:13:56
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biosun1988 at 2014-03-25 20:13:56
我buffer就是常用的RIPA,以前没有遇到这种问题.
我先直接跑了电泳,发现上样后颜色变为蓝色了,是不是没影响了?...

照你的说法，control好好的，就是IP有，那你拉下来的蛋白太酸？
我觉得你最好加点Tris pH6.8，你加到孔里变回去了，说明running buffer（pH~10.4）帮你调节了一下。但是毕竟就是上样那么一会的事情，有可能没有混均匀。
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4楼2014-03-25 20:41:13
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yuanyuanlg01

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
biosun1988: 金币+5, ★★★很有帮助, 解释了问题的原因,很有帮助. 2014-03-25 20:51:36
同意上边大虾说的，应该是PH太低了。不过之前实验中好像也有过类似现象，不过好像也是偶然。不过变黄的话，如果溴酚蓝没问题的话就一定是PH的问题，会不会和你加热有关系呢。然后上样之后温度下来了就好了。如果你的样品中间没有发生不可逆变化（沉淀，变性等等）的话我觉得可以先不用在意。希望有帮助谢谢，多多交流
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5楼2014-03-25 20:42:00
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biosun1988

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-25 20:41:13
照你的说法，control好好的，就是IP有，那你拉下来的蛋白太酸？
我觉得你最好加点Tris pH6.8，你加到孔里变回去了，说明running buffer（pH~10.4）帮你调节了一下。但是毕竟就是上样那么一会的事情，有可能没有混 ...

我应该已经混匀了,先跑下看看吧,这次情况比较偶然,最大的担心是会影响wb.看了大家的回复感觉应该不会.谢.
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6楼2014-03-25 20:54:08
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biosun1988

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yuanyuanlg01 at 2014-03-25 20:42:00
同意上边大虾说的，应该是PH太低了。不过之前实验中好像也有过类似现象，不过好像也是偶然。不过变黄的话，如果溴酚蓝没问题的话就一定是PH的问题，会不会和你加热有关系呢。然后上样之后温度下来了就好了。如果你的 ...

先跑下看看吧,这次情况比较偶然,最大的担心是会影响wb.看了大家的回复感觉应该不会.谢.
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7楼2014-03-25 20:54:23
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weskerZXC

银虫 (小有名气)
我们5乘的loading，正常情况下是黄色的，但是加入样品后变成蓝色，楼主的loading是不是太浓了
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8楼2014-03-26 13:55:12
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白羽枪

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biosun1988 at 2014-03-25 20:13:56
我buffer就是常用的RIPA,以前没有遇到这种问题.
我先直接跑了电泳,发现上样后颜色变为蓝色了,是不是没影响了?...

PH问题，
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9楼2014-04-13 10:48:18
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安小米

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by biosun1988 at 2014-03-25 20:54:23
先跑下看看吧,这次情况比较偶然,最大的担心是会影响wb.看了大家的回复感觉应该不会.谢....

楼主后来跑出来了没有啊？我也遇到了同样的问题，是样品的原因吗？到底是什么原因呢？
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10楼2017-08-16 21:08:09
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