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紫乐唤

新虫 (初入文坛)

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[求助] 真诚求助在六孔板做Caco-2细胞药物转运实验已有1人参与

最近在做Caco-2细胞，接种在六孔板的transwell小室上面，可是都养好长时间电阻一直也只有70,80左右，不知道怎么回事？
还有想做成功这个实验的好人，多给我说一些做这个实验的小细节，因为急等毕业，谢谢各位了

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1楼 2014-03-25 15:39:30

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jakytam

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【答案】应助回帖

这个原因太多了。因为这个模型要花很长时间，技术环节多，任何一个环节出问题，结果就不妙。所以你的问题较难回答。我按自己认为重要程度的顺序试着不完全的回答：
1. 消化，既要充分又不能过分。
  我认为消化环节是Caco-2模型成功的最关键因素之一。在细胞融合度大于95%时进行消化，首先用PBS洗涤一下，吸干再加5mLPBS，放进培养箱孵育5min，尽量去除培养基；吸干加入胰酶消化5min以上，呈细沙状时，加入4倍以上胰酶体积的培养基，用5mL枪使劲吹打(壮男15下，弱女子吹打20下以上)，计数时观察细胞，应该都是单个散在的。如果有2个或以上细胞成团，说明吹打不够；如果细胞大小不一，可能吹打过了。
以250000个细胞/ml的密度接种transwell，隔天换液即可。
2. 污染，培养时间长，半开放培养的模型对无菌操作有很高的要求
无菌操作就不讲了
3. 营养要求高
高塘DMEM培养基，现加NEAA、谷氨酰胺、FBS(GIBCO)，一瓶用完后再配下一瓶
4.细胞层很娇嫩，需要呵护
  换液不能用枪，水流速度太大，需要用10ml移液管。在接种后的第一次换液，尤其要温柔。
5.测量电阻的技巧
  在培养基中测电阻一般会比HBSS中高；在做转运实验前夜必须换液；HBSS洗涤一次，电阻会降一次，如果信心不足，就不要洗3次了；还可洗涤后，在摇床平衡后再测，电阻会上升一些。