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DandelionLS

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 质粒图谱询问已有1人参与

我初进实验室，看不懂质粒图谱啊，
T7启动子怎么和lacZ的方向相反啊，我要插入基因，怎样插入才可以表达呢？

质粒图谱

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1楼 2014-03-25 11:00:36

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gyesang

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引用回帖:

5楼: Originally posted by DandelionLS at 2014-03-25 17:07:01
既然lacZ可以表达，是不是我插入的基因也可以微量表达呢？
既然是克隆载体，那它的T7启动子是干什么用的呢？
它的方向是不是与LacZ相反呢？...

你首先对相关的原理还没有搞清楚，什么时候用克隆载体，什么时候用表达载体

既然lacZ可以表达，是不是我插入的基因也可以微量表达呢？
1. 如果你选择T-A克隆方法插入载体，你需要先筛选下你基因的方向；
2. 即使方向是对的，你的基因还要看是否能和Lac Z基因的N端融合，如果能融合，你的基因当然能够进行表达

既然是克隆载体，那它的T7启动子是干什么用的呢？
T7启动子在这里跟你基因体内表达没有任何关系，这个载体有或者没有T7效果都是一样，加T7的启动子的一个好处是可以在T7 polymerase的作用下进行体外转录

它的方向是不是与LacZ相反呢？
如果你将基因克隆在T7启动子的下游，在DH5a是可以表达，但DH5a不是表达蛋白的合适菌株，如果你克隆进BL21，由于没有LacI的表达，所以不能进行诱导