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liulongbo358

铜虫 (小有名气)

[求助] 激光共聚焦的在观察拟南芥保卫细胞中ROS的问题 已有2人参与

在观察拟南芥保卫细胞中ROS时，使用了H2DCF-DA进行30min中孵育后，进行观察，使用leica激光共聚焦进行观察，调好gian值后，图片的背景不知道怎么会逐渐变亮？不知道这是什么问题？请各位大神帮忙看下，3Q。

激光共聚焦的在观察拟南芥保卫细胞中ROS的问题
good_00_ch00.jpg


激光共聚焦的在观察拟南芥保卫细胞中ROS的问题-1
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激光共聚焦的在观察拟南芥保卫细胞中ROS的问题-2
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激光共聚焦的在观察拟南芥保卫细胞中ROS的问题-3
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1楼 2014-03-17 20:32:49
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myblin

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你加完H2DCF-DA孵育之后，最好用水洗一下，再进行观察。有时信号会penetration等。因为所有的细胞中都会有ROS，只是量多少的问题。
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2楼2014-03-17 21:45:43
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liulongbo358

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by myblin at 2014-03-17 21:45:43
建议你加完H2DCF-DA孵育之后，最好用水洗一下，再进行观察。有时信号会penetration等。因为所有的细胞中都会有ROS，只是量多少的问题。

嗯，谢谢您的回答。我在孵育之后使用负载液进行过三次清洗。开始在显微镜下观察时感觉还挺清晰，但是过段时间观察时就感觉没有那么清晰，视野中到处是淡淡的荧光。之前有怀疑是染料出问题了，之后又新买了sigma的新染料做过后，仍然是这样，不知道问题出在哪里。
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3楼2014-03-18 08:52:45
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liulongbo358

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by myblin at 2014-03-17 21:45:43
建议你加完H2DCF-DA孵育之后，最好用水洗一下，再进行观察。有时信号会penetration等。因为所有的细胞中都会有ROS，只是量多少的问题。

哦，谢谢您的回答。我是在孵育过后使用负载液清洗的，清洗三次后制片观察。在刚开始置于显微镜下观察时感觉挺清晰的，但是过段时间，也就10几分钟的样子就没有那么清晰了，感觉视野中到处有一层淡淡的荧光。不知是什么原因。之前有怀疑是H2DCF-DA失活了，又重新从sigma新买了染料，但是问题还是一样。这张图还能好一些，其它的对照观察过程中，总是降低的很快，3-10min钟就很快降低了。谢谢您的帮助，还希望大神指点迷津。
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4楼2014-03-18 09:01:57
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myblin

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liulongbo358 at 2014-03-18 09:01:57
哦，谢谢您的回答。我是在孵育过后使用负载液清洗的，清洗三次后制片观察。在刚开始置于显微镜下观察时感觉挺清晰的，但是过段时间，也就10几分钟的样子就没有那么清晰了，感觉视野中到处有一层淡淡的荧光。不知是 ...

荧光时间会淬灭的，特别是这种比较敏感的燃料。呵呵呵
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5楼2014-03-18 16:29:08
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liulongbo358

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by myblin at 2014-03-18 16:29:08
荧光时间会淬灭的，特别是这种比较敏感的燃料。呵呵呵...

哦，是的。我问过这方面的老师，他说荧光会淬灭，但是我们用的激发光不是很强，按照一般情况来说是不会淬灭太严重。但是背景不知道怎么会逐渐变亮？不管怎么后很感谢您的帮助。
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6楼2014-03-18 23:23:48
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myblin

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liulongbo358 at 2014-03-18 23:23:48
哦，是的。我问过这方面的老师，他说荧光会淬灭，但是我们用的激发光不是很强，按照一般情况来说是不会淬灭太严重。但是背景不知道怎么会逐渐变亮？不管怎么后很感谢您的帮助。...

呵呵呵，不客气~~~~
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7楼2014-03-19 12:19:59
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songsongsa

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我觉得这个只是你一个对比度的问题，背景的东西是一直存在的，只不过刚开始有些地方很亮，显微镜显示的时候 会自动调节对比度，所以看起来背景是没有东西的，后面荧光bleach了，背景就显出来了。如果可以，试试调节下图像的对比度，把最小和最大强度调成一致，比较下就知道了。或者读一下背景光强，比较一下。
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8楼2014-03-21 16:27:42
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