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liulongbo358

铜虫 (小有名气)

[求助] 激光共聚焦的在观察拟南芥保卫细胞中ROS的问题 已有2人参与

在观察拟南芥保卫细胞中ROS时,使用了H2DCF-DA进行30min中孵育后,进行观察,使用leica激光共聚焦进行观察,调好gian值后,图片的背景不知道怎么会逐渐变亮?不知道这是什么问题?请各位大神帮忙看下,3Q。

激光共聚焦的在观察拟南芥保卫细胞中ROS的问题
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激光共聚焦的在观察拟南芥保卫细胞中ROS的问题-1
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激光共聚焦的在观察拟南芥保卫细胞中ROS的问题-2
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激光共聚焦的在观察拟南芥保卫细胞中ROS的问题-3
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liulongbo358

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by myblin at 2014-03-17 21:45:43
建议你加完H2DCF-DA孵育之后,最好用水洗一下,再进行观察。有时信号会penetration等。因为所有的细胞中都会有ROS,只是量多少的问题。

哦,谢谢您的回答。我是在孵育过后使用负载液清洗的,清洗三次后制片观察。在刚开始置于显微镜下观察时感觉挺清晰的,但是过段时间,也就10几分钟的样子就没有那么清晰了,感觉视野中到处有一层淡淡的荧光。不知是什么原因。之前有怀疑是H2DCF-DA失活了,又重新从sigma新买了染料,但是问题还是一样。这张图还能好一些,其它的对照观察过程中,总是降低的很快,3-10min钟就很快降低了。谢谢您的帮助,还希望大神指点迷津。
4楼2014-03-18 09:01:57
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myblin

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议你加完H2DCF-DA孵育之后,最好用水洗一下,再进行观察。有时信号会penetration等。因为所有的细胞中都会有ROS,只是量多少的问题。
2楼2014-03-17 21:45:43
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liulongbo358

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by myblin at 2014-03-17 21:45:43
建议你加完H2DCF-DA孵育之后,最好用水洗一下,再进行观察。有时信号会penetration等。因为所有的细胞中都会有ROS,只是量多少的问题。

嗯,谢谢您的回答。我在孵育之后使用负载液进行过三次清洗。开始在显微镜下观察时感觉还挺清晰,但是过段时间观察时就感觉没有那么清晰,视野中到处是淡淡的荧光。之前有怀疑是染料出问题了,之后又新买了sigma的新染料做过后,仍然是这样,不知道问题出在哪里。
3楼2014-03-18 08:52:45
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myblin

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by liulongbo358 at 2014-03-18 09:01:57
哦,谢谢您的回答。我是在孵育过后使用负载液清洗的,清洗三次后制片观察。在刚开始置于显微镜下观察时感觉挺清晰的,但是过段时间,也就10几分钟的样子就没有那么清晰了,感觉视野中到处有一层淡淡的荧光。不知是 ...

荧光时间会淬灭的,特别是这种比较敏感的燃料。呵呵呵
5楼2014-03-18 16:29:08
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