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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » ATP对蛋白稳定性的影响
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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] ATP对蛋白稳定性的影响

在做蛋白与tRNA的binding实验时，加了ATP导致蛋白沉淀，ATP浓度为10mM，加AMP或AMPPNP代替，情况稍微好一点，但也有部分沉淀。因为没有加氨基酸，所以应该还没有反应，是因为静电作用或是空间位阻的原因引起蛋白构型发生较大变化而沉淀吗？还请各位了解tRNA氨酰化过程的帮忙分析下原因呀。。。
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1楼 2014-03-05 15:33:17
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
笔冰河: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-03-06 16:49:08
笔冰河: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-03-06 19:53:37
蛋白能与RNA结合，说明蛋白表面是带正电的，ATP是酸性的，加了ATP导致酸碱中和，降低了蛋白质的溶解度，所以沉淀。
ATP的酸性很强，请问你配制ATP时有没有用NaOH调pH值啊？最好把ATP调成近似中性的，吸一微升用pH试纸检测就行。
如果还不行的话，可能要改变一下蛋白所处缓冲液的pH值。
如果还不行的话，考虑增加一下离子强度，总之问题应该是出在蛋白溶解度上，往这个方向改进实验应该会有帮助。

希望对你有帮助。
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2楼2014-03-05 18:25:40
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihe131 at 2014-03-05 18:25:40
蛋白能与RNA结合，说明蛋白表面是带正电的，ATP是酸性的，加了ATP导致酸碱中和，降低了蛋白质的溶解度，所以沉淀。
ATP的酸性很强，请问你配制ATP时有没有用NaOH调pH值啊？最好把ATP调成近似中性的，吸一微升用pH试 ...

我的ATP溶液是直接用pH7.6的tris-HCl溶解粉末配制的，溶解后没有调pH。
NaCl浓度为100mM,离子浓度高于100mM tRNA无法binding到蛋白上，但这个离子浓度下蛋白又不稳定，容易聚集沉淀，好纠结啊。。
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3楼2014-03-06 18:30:35
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihe131 at 2014-03-05 18:25:40
蛋白能与RNA结合，说明蛋白表面是带正电的，ATP是酸性的，加了ATP导致酸碱中和，降低了蛋白质的溶解度，所以沉淀。
ATP的酸性很强，请问你配制ATP时有没有用NaOH调pH值啊？最好把ATP调成近似中性的，吸一微升用pH试 ...

重新测了一下ATP溶液的pH, 发现用pH7.6tris-HCl溶解的ATP，只有pH3左右，额。。。原来都还没到tris的缓冲区间，难怪一加蛋白就沉，非常感谢大侠的解答，帮我解决了纠结一个多月的问题。。。
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4楼2014-03-06 19:57:13
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笔冰河

银虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by lihe131 at 2014-03-05 18:25:40
蛋白能与RNA结合，说明蛋白表面是带正电的，ATP是酸性的，加了ATP导致酸碱中和，降低了蛋白质的溶解度，所以沉淀。
ATP的酸性很强，请问你配制ATP时有没有用NaOH调pH值啊？最好把ATP调成近似中性的，吸一微升用pH试 ...

还有一个问题想请教一下，对化学不太懂，让大侠见笑了，我用的ATP是ATP二钠盐，也就是磷酸根而已，不应该是吸质子吗，为什么还能释放氢离子，酸性这么强呢？
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5楼2014-03-06 20:02:21
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihe131 at 2014-03-05 18:25:40
蛋白能与RNA结合，说明蛋白表面是带正电的，ATP是酸性的，加了ATP导致酸碱中和，降低了蛋白质的溶解度，所以沉淀。
ATP的酸性很强，请问你配制ATP时有没有用NaOH调pH值啊？最好把ATP调成近似中性的，吸一微升用pH试 ...

ATP是强酸性，加入后，蛋白表面不是应该带更多地正电荷了吗？
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6楼2014-03-06 23:01:59
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)
呵呵，可能之前的解释有误。
第一个问题，ATP有三个磷酸根，能释放四个氢离子，而钠盐还不足以中和其酸性。
第二个问题，虽然ATP使得蛋白带电更强了，但是由于其pH值太低，导致了蛋白变性沉淀。

我之前做蛋白-DNA结合的时候，将核酸加入蛋白导致蛋白沉淀，相互作用时是由于酸碱中和导致的溶解度降低。我把你的情况和我的情况搞混了，好在没给你带来麻烦，抱歉！
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7楼2014-03-07 09:42:40
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)
请问你现在ATP调好pH之后，加入蛋白中，蛋白还沉淀吗？问题解决了吗？
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8楼2014-03-07 10:11:56
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lihe131 at 2014-03-07 09:42:40
呵呵，可能之前的解释有误。
第一个问题，ATP有三个磷酸根，能释放四个氢离子，而钠盐还不足以中和其酸性。
第二个问题，虽然ATP使得蛋白带电更强了，但是由于其pH值太低，导致了蛋白变性沉淀。

我之前做蛋白- ...

多谢你的及时回复，问题已经解决了，好开心啊，非常感谢，呵呵。。。
因为化学不是很好，总在这些小问题上纠结，关于酸碱中和还是不太理解，为什么你将核酸和蛋白加到一块就会沉淀呢，是核酸中和了蛋白表面碱性氨基酸NH3+的氢离子，导致蛋白带电少而相互吸引沉淀吗？可是核酸带负电不应该只是与蛋白相互吸引，它应该是酸性，应该没法夺取表面的正电荷吧？电化学理论知识好难啊。。。
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9楼2014-03-07 10:29:51
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 笔冰河 at 2014-03-07 10:29:51
多谢你的及时回复，问题已经解决了，好开心啊，非常感谢，呵呵。。。
因为化学不是很好，总在这些小问题上纠结，关于酸碱中和还是不太理解，为什么你将核酸和蛋白加到一块就会沉淀呢，是核酸中和了蛋白表面碱性氨 ...

举个例子啊：
假如我在pH7.0的缓冲液中分别准备蛋白和核酸。蛋白是碱性的，等电点9.0；核酸是酸性的，等电点是5.0。
此时他们都能溶解：等电点9.0的蛋白在7.0的缓冲液中带正电；等电点5.0的核酸在7.0的缓冲液中带负电。以为表面都带电，所以都能溶解。
然而，我把它们混合后，形成了复合物，带正电的蛋白和带负电的核酸彼此中和典型，导致复合物的等电点变为7.0，而缓冲液也是7.0，所以复合物表面就不带电了，就不溶解了。

这只是个例子啊，数都是编的，希望对你有帮助。
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10楼2014-03-07 10:41:36
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