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山西小愚

银虫 (初入文坛)

[求助] 粗酶液以ABTS为底物测定漆酶活性，死活感觉测不到酶活力。求指点！！！ 已有3人参与

正在培育一株产漆酶的菌，可以降解部分有机物，粗酶液上清液用ABTS水溶液为底物1mM浓度检测，ABTS水溶液呈现淡蓝色。从美国Sigma公司买的。但是反应十分钟OD与空白比较只是增加了0.1。粗酶液蛋白总含量是19mg/ml.缓冲液PH4.5 菌体破碎上清液、沉淀、培养基都测了。只有上清在OD420处还稍微有点变化，十分钟OD增加只是0.1.怎么测都不行。求指点。谢谢！！！
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1楼 2014-03-05 15:24:56
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sea4on

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by louchunxia at 2015-09-10 17:22:12
你好，你用ABTS测酶活的具体操作是什么，我正在做，无法测出有效数据，谢谢？...

体系：200 μL
①10 mM ABTS                    20 μL
（10 mM ABTS用HAc-NaAc缓冲溶液（pH4.8）配制，实验所需终浓度为1 mM）
②HAc-NaAc缓冲溶液（pH4.8）    160 μL
③酶液                           20μL

用酶标仪在420nm进行动力学测定
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6楼2017-06-04 16:36:01
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dllchina: 金币+3, 鼓励热心应助 2014-03-06 18:48:11
你的粗酶液是发酵上清还是细胞破碎后的上清？
测定酶活力前，应该跑个SDS-PAGE看看，别你的蛋白都没有或者浓度特别低还在那反复测。你测定的是总蛋白含量，说明不了什么问题。

漆酶都已经是几年前的热点了，测定酶活的方式还是比较成熟的。将底物掺到琼脂平板中，滴加粗酶液，看是否能形成透明圈（需要染色）。

另外你的粗酶液是发酵罐还是摇瓶得到的？摇瓶酶活应该很低吧，很难测得到。而且你粗酶液没有除盐，也没有浓缩。可以考虑超薄切向流除盐，然后透析膜浓缩，再测酶活。
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2楼2014-03-06 15:04:14
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山西小愚

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by reallpf at 2014-03-06 15:04:14
你的粗酶液是发酵上清还是细胞破碎后的上清？
测定酶活力前，应该跑个SDS-PAGE看看，别你的蛋白都没有或者浓度特别低还在那反复测。你测定的是总蛋白含量，说明不了什么问题。

漆酶都已经是几年前的热点了，测定 ...

谢谢你，我的是摇瓶24小时的，细胞破碎后上清液，一直都测不到不敢直接去克隆。我再试试平板，老板让直接克隆表达了看看有没有活力。还有Sigma公司那个ABTS药品标签质量是10毫克，然后我电子天平显示大于这个质量，几乎是30毫克这样子，我就电子天平的称了。不知道这个有遇到过没，还是他们公司标记有什么换算吗？文献说ABTS水溶液可以存放在四度避光6个月，不知道有测过吗？能放那么长时间吗？谢谢！！
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3楼2014-03-06 17:26:58
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小-浅

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我最近也在做这方面的，用ABTS测定酶活的，不知道具体怎么去做
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简单点，随意点
4楼2015-05-26 22:38:44
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