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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » dpn1酶的具体使用方法
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思念de季节

金虫 (小有名气)

[求助] dpn1酶的具体使用方法 已有2人参与

在用片段敲除大肠杆菌基因过程中，我想将pcr后的敲除片段用dpn1酶处理一下消除模板，请问具体怎么做？多大的体系加多少酶？还要加缓冲液吗？还是直接在pcr体系里加酶？
求大神指导啊！

[ Last edited by 思念de季节 on 2014-2-20 at 16:58 ]
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1楼 2014-02-20 16:55:58
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 思念de季节 at 2014-02-20 19:15:46
过夜不会太久了吗？而且我pcr的量很多，有几百ul，是把它们合起来切还是分开？...

这个，这么大的量使用DpnI有点浪费，没有经验。
少量模板还可以使用该酶来处理，还比较干净。
如果有别的办法还是不要这么干的好。
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6楼2014-02-20 23:30:59
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
其实这个都行。我做点突的时候，取10ul体系，加1ul DpnI, TaKaRa公司的酶可以不用buffer，直接用酶37°C消化过夜。
祝好！
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2楼2014-02-20 17:10:13
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DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
基本上不用加buffer，你的模版才几十ng吧，我们都是加1ul酶，一小时就足够了。你要是实在不放心，可以做个对照看看，一个反应里面不加pcr的聚合酶，然后同时消化转化看克隆数就知道了。
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3楼2014-02-20 18:00:46
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思念de季节

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-02-20 17:10:13
其实这个都行。我做点突的时候，取10ul体系，加1ul DpnI, TaKaRa公司的酶可以不用buffer，直接用酶37°C消化过夜。
祝好！

过夜不会太久了吗？而且我pcr的量很多，有几百ul，是把它们合起来切还是分开？
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4楼2014-02-20 19:15:23
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