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思念de季节

金虫 (小有名气)

[求助] dpn1酶的具体使用方法 已有2人参与

在用片段敲除大肠杆菌基因过程中,我想将pcr后的敲除片段用dpn1酶处理一下消除模板,请问具体怎么做?多大的体系加多少酶?还要加缓冲液吗?还是直接在pcr体系里加酶?
求大神指导啊!

[ Last edited by 思念de季节 on 2014-2-20 at 16:58 ]
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 思念de季节 at 2014-02-20 19:15:46
过夜不会太久了吗?而且我pcr的量很多,有几百ul,是把它们合起来切还是分开?...

这个,这么大的量使用DpnI有点浪费,没有经验。
少量模板还可以使用该酶来处理,还比较干净。
如果有别的办法还是不要这么干的好。
6楼2014-02-20 23:30:59
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
其实这个都行。我做点突的时候,取10ul体系,加1ul DpnI, TaKaRa公司的酶可以不用buffer,直接用酶37°C消化过夜。
祝好!
2楼2014-02-20 17:10:13
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DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
基本上不用加buffer,你的模版才几十ng吧,我们都是加1ul酶,一小时就足够了。你要是实在不放心,可以做个对照看看,一个反应里面不加pcr的聚合酶,然后同时消化转化看克隆数就知道了。
3楼2014-02-20 18:00:46
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思念de季节

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-02-20 17:10:13
其实这个都行。我做点突的时候,取10ul体系,加1ul DpnI, TaKaRa公司的酶可以不用buffer,直接用酶37°C消化过夜。
祝好!

过夜不会太久了吗?而且我pcr的量很多,有几百ul,是把它们合起来切还是分开?
4楼2014-02-20 19:15:23
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