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黑猩猩

兑换贵宾

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[求助] 将一个基因的几段外显子拼在一起 已有8人参与

我通过PCR产物直接测序将一个基因的三段外显子测出来了，但是如何将这三段外显子拼起来，求指教！
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1楼 2014-02-20 11:12:30
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Fleaves

版主

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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-02-22 12:49:47
提取RNA，用cDNA做模板
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3楼2014-02-20 12:43:10
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普通回帖

shiyiyaya

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-22 12:48:45
使用overlap PCR。在几个外显子的连接处设计引物，能与前后两段完全互补。第一轮PCR结束之后，各取一点产物，再使用外侧的引物扩增。
祝好！
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2楼2014-02-20 11:54:53
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Fleaves

管理员

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
2楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-02-20 11:54:53
使用overlap PCR。在几个外显子的连接处设计引物，能与前后两段完全互补。第一轮PCR结束之后，各取一点产物，再使用外侧的引物扩增。
祝好！

太麻烦了吧
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4楼2014-02-20 12:43:31
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feilinshiji

版主

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引用回帖:
4楼: Originally posted by Fleaves at 2014-02-20 12:43:31
太麻烦了吧...

这已经是最简单的办法了，经费充足的话可以直接送公司合成
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5楼2014-02-20 13:43:17
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北极胖熊

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
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使用1楼的错拼法，不麻烦
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6楼2014-02-20 15:41:26
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鬼羽帝魂

管理员

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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-02-22 12:49:34
可以SOE-PCR进行拼接
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7楼2014-02-20 16:01:28
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grape_vine

管理员

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直接在第一个和第三个外显子两端设计引物不就行了吗? 说实话,没看懂问题
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8楼2014-02-21 23:18:12
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cs2951819

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
非常同意一楼的做法，毕竟合成太贵了，如果资金不够的话

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2014-02-22 08:47:37
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西瓜

无虫
★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+5, 老版主热心！ 2014-02-22 12:49:23
Overlap PCR如果产物很长的话不容易做。做的话建议两两融合，同时融合三个片段会难很多。
个人更倾向于3楼的说法。提RNA，再反转录得到没有内含子的cDNA，然后用cDNA为模板直接扩增三个外显子。

如果技术成熟，都顺利的话，用cDNA扩增比Overlap PCR要快很多。当然，前者的试剂成本也高一点，但是得到的cDNA可以长期保存，也可以扩其他东西。不过我认为前者技术难度小一些，后者中间卡住的几率还是蛮高的。时间也是成本。

两者都是可行的，楼主结合自己对两种技术的掌握程度，还有实验室的情况选吧。
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10楼2014-02-22 11:24:23
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