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连接时载体去磷 已有3人参与
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载体和目的片段链接的时候，因为载体自连，阳性很少，所以用碱性磷酸酶处理载体去磷，再和目的片段连接，以提高连接效率。 我想问一下，去磷的反应条件是什么，然后怎么把载体上的磷酸酶去掉终止反应，80度反应20分钟会不会让DNA双链开环，还有没有其他方法？连接时目的片段怎么处理？PCR回收后就可以用T4连接酶连了吗？ |
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luwei13566
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gyesang
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2楼2014-02-19 17:27:42
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一般来说，载体去磷酸化不好掌握。如果不用尽量不用。 http://www.51atgc.com/shiyanjish ... 0-01-17/1226_2.html |
3楼2014-02-19 17:28:15
shiyiyaya
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我们去磷的时候用SAP，小牛磷酸酶等，他们都有对应的buffer，也是按照说明书做的。灭活的时候65°C即可，20min。 直接胶回收，回收柱的那种简单回收，去掉盐离子就行。后续连接正常。 祝顺利！ |
4楼2014-02-19 17:45:39
