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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 不需要加入引物进行PCR的问题
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pxmyz

银虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
无引物PCR应该称作DNA体外同源重组PCR（DNA shuffling），是专门用于进行突变育种。它首先要用DNase I消化功能相同的一组基因片段（A），从而产生随机小片段（B），然后提纯后用无引物PCR（经变性后可互为引物）重新装配这些小片段成完整的大片段。
但楼主说的那个问题不属于无引物PCR，可能涉及到重组PCR，你只是要把两个片段通过PCR的方法连接起来，而没有要突变的意思，对吧？这两个片段虽然有一段互补区，但仍需要一段和两条引物均有互补的区域，也就是说的搭桥引物。好好看看怎么设计重组PCR引物，祝成功。
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Ican，Ido.
11楼2008-01-22 10:49:26
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
1.这是该酶说明书：
http://www.isload.com.cn/store/u ... 6_2004.pdf/downlaod
它是一种混合酶，保真性介于高保真酶与传统酶之间，它的产物80%末端加A，但还是有20%不加A，重叠延伸就是靠这20%
2.你原来的两个片段是用什么酶扩增的？我是用EX taq酶，也有人用PlusⅡ taq。加了A的片段肯定不能重叠延伸的。
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12楼2008-01-22 11:18:46
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
over lap PCR。酶应当使用高保真不加A的，如生工的PFU。应该加上两条侧翼引物。适当调整PCR条件。延长延伸时间等。
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金币是赌出来的
13楼2008-01-22 14:13:51
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ypan

木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
这个有点象重组PCR，我去年暑假就用这种方法做过，并且获得成功！
反应体系和普通PCR一样，我用的聚合酶是Taq plus I
反应程序为：
94度预变性10分钟
94变性30秒；
65退火30秒；
72延伸30秒。
72继续延伸5分钟。
总共进行约15个循环。
退火温度的确定可以用oligo把重叠部分当成引物来确定，当然还是要靠经验！
不过感觉你的重叠部分太短了，建议重叠互补区域30个碱基！
祝你成功!
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14楼2008-01-22 20:13:45
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lybio

金虫 (正式写手)
感谢小木虫提供的平台！
感谢大家热情提供的意见！！
感谢PCR带来的挑战和成功喜悦！！！
革命尚未成功，同志仍需努力，更确切地说它只是处于万里长征的第一步。
需要学习的太多了，同“门”战友的鼓励是最大的支持，让大家一起进步并收获着……
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15楼2008-01-22 23:39:06
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
我用类似的方法延伸过7kb的片段
因为片断长我最后用的Roch 的 expand and long taq polymerase.
个人感觉ypan的方案很具参考价值，思路类似。
不过我的AT 2min,
为了提高产量，最好还是加引物，或者用这步反应的产物作模板再P一下。
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16楼2008-01-23 07:34:10
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lybio

金虫 (正式写手)
★ ★
asr(金币+2,VIP+0):恭喜！^_^
大家好！感谢大伙提供的帮助,已经P出来了.
以下是我做的PCR条件,供大家参考讨论
25uL反应体系:
    纯化的两条DNA片断各0.5uL(用PFU酶P)
    taq酶 (0.25U/L)        2uL
    PCR Buffer                2.5uL
   dNTP                         2ul
   加灭菌DD水至25uL
   PCR条件: 94℃ 5min  , 94℃ 30s , 50℃ 2min,  72℃ 4min  循环8次, 最后延伸5min.
   后往管中加入0.5ul 引物P1和P4,怕酶失活过多,再加 0.5uL. PCR条件:94℃ 5min  , 94℃ 30s , 56℃ 30s,  72℃ 4min     循环20次, 最后延伸5min.
  跑电泳后,目的片断很亮,还有少量未延伸的两条DNA片断. 但有拖带现象(>目的片断KB数),以及在目的片断下面(<目的片段KB数)有阴影(窄的,不亮区域),不知道是什么原因?

[ Last edited by lybio on 2008-2-29 at 21:37 ]
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17楼2008-02-29 21:36:15
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by lybio at 2008-2-29 14:36:
大家好！感谢大伙提供的帮助,已经P出来了.
以下是我做的PCR条件,供大家参考讨论
25uL反应体系:
    纯化的两条DNA片断各0.5uL(用PFU酶P)
    taq酶 (0.25U/L)        2uL
    PCR Buffer                2.5 ...

最好有电泳图,想得到单一带,最好在进行一步nest PCR
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18楼2008-03-01 04:50:30
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lybio

金虫 (正式写手)

重叠延伸PCR电泳图

reasonspare(金币+0,VIP+0):你最好还是重新发帖求助,这样比在原来帖子后面继续求助要好一些.
附件是重叠延伸PCR，跑电泳的图。谢谢指教！
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19楼2008-03-01 13:20:10
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lybio at 2008-3-1 13:20:
附件是重叠延伸PCR，跑电泳的图。谢谢指教！

建议发到网盘里，下载附件要收费的呢！
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20楼2008-03-02 19:16:08
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