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lybio金虫 (正式写手)
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[交流]
不需要加入引物进行PCR的问题
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| 分别用两对引物扩增出两条目的DNA片断，这两条链5端和3端有20个互补碱基。现在以扩增出的这两条DNA链，互为模板和引物，不需要另加引物，扩增一段长的链。想请教有经验的人，反应体系一般是怎样的？谢谢！ |
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asr(金币+2,VIP+0):恭喜！^_^
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大家好！感谢大伙提供的帮助,已经P出来了. 以下是我做的PCR条件,供大家参考讨论 25uL反应体系: 纯化的两条DNA片断各0.5uL(用PFU酶P) taq酶 (0.25U/L) 2uL PCR Buffer 2.5uL dNTP 2ul 加灭菌DD水至25uL PCR条件: 94℃ 5min , 94℃ 30s , 50℃ 2min, 72℃ 4min 循环8次, 最后延伸5min. 后往管中加入0.5ul 引物P1和P4,怕酶失活过多,再加 0.5uL. PCR条件:94℃ 5min , 94℃ 30s , 56℃ 30s, 72℃ 4min 循环20次, 最后延伸5min. 跑电泳后,目的片断很亮,还有少量未延伸的两条DNA片断. 但有拖带现象(>目的片断KB数),以及在目的片断下面(<目的片段KB数)有阴影(窄的,不亮区域),不知道是什么原因? [ Last edited by lybio on 2008-2-29 at 21:37 ] |
17楼2008-02-29 21:36:15
2楼2008-01-18 18:40:59
lybio
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