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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 不需要加入引物进行PCR的问题
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lybio

金虫 (正式写手)

[交流] 不需要加入引物进行PCR的问题

分别用两对引物扩增出两条目的DNA片断，这两条链5端和3端有20个互补碱基。现在以扩增出的这两条DNA链，互为模板和引物，不需要另加引物，扩增一段长的链。想请教有经验的人，反应体系一般是怎样的？谢谢！
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1楼 2008-01-18 09:48:30
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weiwei1

木虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):楼主又发问了.请你再辛苦一下.
你是说，两条片段完全互补，要变成一条双链DNA，是吗？
直接把两条片段混合，放在PCR仪内，95度5分钟，然后关掉PCR仪，过夜即可。
需要配退火缓冲液。
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2楼2008-01-18 18:40:59
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lybio

金虫 (正式写手)
不是，这两条链分别有900KB和1000K，而且是已经扩增出来的双链。其中一条链（由引物P1和P2扩增）的5‘末端和另一条链（由引物P3和P4扩增）3’末端有20个碱基互补（因为P2和P3是互补的两条引物），现在就想在25UL体系里加入这两条链，taq酶，底物等，而不加其他引物来扩增长的为1900KB(900+1000)的DNA链，想知道反应体系一般是怎样的？
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3楼2008-01-18 23:32:26
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
这种PCR叫什么呢？我还没听过，但比较有意思，而我有点怀疑可行性。退火的时候两条只有20BP的链会结合吗？与自身的互补链结合不是更有优势吗？
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4楼2008-01-19 11:44:17
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lybio

金虫 (正式写手)
好像是叫融合PCR，我也是今天才看到的
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5楼2008-01-19 18:01:22
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.兄弟很热心.
1.应该叫重叠延伸PCR！我做过，但是我加了一对侧翼引物，这样才能扩增啊，不然怎么叫PCR呢，只能叫重叠延伸。
2.请问你这两个片段是回收后再混合进行PCR的吗？原则上要求两个片段的摩尔数相等。
3.但是你打算完全不加引物吗？那你的产物浓度估计很小，电泳很难检测到哦！劝你还是加上一对侧翼引物吧！
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6楼2008-01-19 18:57:54
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by skkyy88888 at 2008-1-19 11:44:
这种PCR叫什么呢？我还没听过，但比较有意思，而我有点怀疑可行性。退火的时候两条只有20BP的链会结合吗？与自身的互补链结合不是更有优势吗？

短片段的退火应该更有优势
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7楼2008-01-19 19:03:01
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lybio

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lihegang2000 at 2008-1-19 18:57:
1.应该叫重叠延伸PCR！我做过，但是我加了一对侧翼引物，这样才能扩增啊，不然怎么叫PCR呢，只能叫重叠延伸。
2.请问你这两个片段是回收后再混合进行PCR的吗？原则上要求两个片段的摩尔数相等。
3.但是你打算完 ...

两条DNA片断是回收后再混合一起，让它们重叠延伸的（没有P出来，可能是因为量太少，检测不出。再加P1，P4到延伸后的管中，继续PCR，但还是没条带）。对于摩尔数的要求，我是选电泳跑出条带亮度基本相同的两条。
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8楼2008-01-21 16:51:27
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
asr(金币+3,VIP+0)::P 多谢，欢迎常来交流！
1.两条片段回收纯化应该是必要的，避免干扰嘛
2.关于模板的量，你的比例应该是对的。我的反应体系是100微升，其中模板总量为10微升，引物各3微升，dNTP 3微升，EX-Taq酶1微升，DMSO 10微升，10×Ex buffer 10微升，加水60微升补足。DMSO用来提高扩增特异性的。
3.反应条件：（我是将230bp的片段与875bp片段重叠延伸得到1077bp片段，所以相对容易些，呵呵。）
①95度预变性5分钟②95度50秒③50度2分钟④72度3分钟⑤最后72度延伸5分钟。
②-④循环30次
建议退火温度在50-60度之间设梯度，摸条件。延伸时间可以适当延长，你的片段长嘛
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9楼2008-01-21 19:09:53
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lybio

金虫 (正式写手)

new problem

taq酶会在两条DNA片断末端会加个A尾，是不是会对重叠延伸造成影响，使它P不出来呢？
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10楼2008-01-22 10:18:32
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