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lybio金虫 (正式写手)
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不需要加入引物进行PCR的问题
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| 分别用两对引物扩增出两条目的DNA片断，这两条链5端和3端有20个互补碱基。现在以扩增出的这两条DNA链，互为模板和引物，不需要另加引物，扩增一段长的链。想请教有经验的人，反应体系一般是怎样的？谢谢！ |
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2楼2008-01-18 18:40:59
lybio
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3楼2008-01-18 23:32:26
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4楼2008-01-19 11:44:17
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5楼2008-01-19 18:01:22
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7楼2008-01-19 19:03:01
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8楼2008-01-21 16:51:27
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asr(金币+3,VIP+0)::P 多谢，欢迎常来交流！
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1.两条片段回收纯化应该是必要的，避免干扰嘛 2.关于模板的量，你的比例应该是对的。我的反应体系是100微升，其中模板总量为10微升，引物各3微升，dNTP 3微升，EX-Taq酶1微升，DMSO 10微升，10×Ex buffer 10微升，加水60微升补足。DMSO用来提高扩增特异性的。 3.反应条件：（我是将230bp的片段与875bp片段重叠延伸得到1077bp片段，所以相对容易些，呵呵。） ①95度预变性5分钟②95度50秒③50度2分钟④72度3分钟⑤最后72度延伸5分钟。 ②-④循环30次 建议退火温度在50-60度之间设梯度，摸条件。延伸时间可以适当延长，你的片段长嘛 |
9楼2008-01-21 19:09:53
lybio
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10楼2008-01-22 10:18:32
