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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 不需要加入引物进行PCR的问题
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lybio

金虫 (正式写手)

[交流] 不需要加入引物进行PCR的问题

分别用两对引物扩增出两条目的DNA片断，这两条链5端和3端有20个互补碱基。现在以扩增出的这两条DNA链，互为模板和引物，不需要另加引物，扩增一段长的链。想请教有经验的人，反应体系一般是怎样的？谢谢！
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1楼 2008-01-18 09:48:30
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ypan

木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
这个有点象重组PCR，我去年暑假就用这种方法做过，并且获得成功！
反应体系和普通PCR一样，我用的聚合酶是Taq plus I
反应程序为：
94度预变性10分钟
94变性30秒；
65退火30秒；
72延伸30秒。
72继续延伸5分钟。
总共进行约15个循环。
退火温度的确定可以用oligo把重叠部分当成引物来确定，当然还是要靠经验！
不过感觉你的重叠部分太短了，建议重叠互补区域30个碱基！
祝你成功!
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14楼2008-01-22 20:13:45
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weiwei1

木虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):楼主又发问了.请你再辛苦一下.
你是说，两条片段完全互补，要变成一条双链DNA，是吗？
直接把两条片段混合，放在PCR仪内，95度5分钟，然后关掉PCR仪，过夜即可。
需要配退火缓冲液。
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2楼2008-01-18 18:40:59
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lybio

金虫 (正式写手)
不是，这两条链分别有900KB和1000K，而且是已经扩增出来的双链。其中一条链（由引物P1和P2扩增）的5‘末端和另一条链（由引物P3和P4扩增）3’末端有20个碱基互补（因为P2和P3是互补的两条引物），现在就想在25UL体系里加入这两条链，taq酶，底物等，而不加其他引物来扩增长的为1900KB(900+1000)的DNA链，想知道反应体系一般是怎样的？
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3楼2008-01-18 23:32:26
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
这种PCR叫什么呢？我还没听过，但比较有意思，而我有点怀疑可行性。退火的时候两条只有20BP的链会结合吗？与自身的互补链结合不是更有优势吗？
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4楼2008-01-19 11:44:17
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