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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Gibson assembly 的一点疑问
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xixi_pds7

银虫 (小有名气)

[交流] Gibson assembly 的一点疑问 已有3人参与

哪位做过Gibson assembly的，请来解答我的一点疑问，gibson assembly是链接两条线型片段的，那么质粒怎么做成线型，而且在需要的地方断开？gibson说是不用任何内切酶，不需要任何酶切位点，那么怎么做到在需要的位置断开的？看protocol上只是说， generate the segments by PCR，可是怎么得到？
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1楼 2014-01-28 07:29:51
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547star

木虫 (著名写手)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-31 12:56:28
根据质粒序列设计两条引物进行PCR扩增得到线型双链DNA。
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为什么
2楼2014-01-31 00:57:30
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xixi_pds7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 547star at 2014-01-31 00:57:30
根据质粒序列设计两条引物进行PCR扩增得到线型双链DNA。

就是不用酶切点了？可以这样理解么，就是说，PCR的时候会产生很多片段，只有含有overlap同源臂的那一段才可以扩增？
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3楼2014-01-31 08:36:30
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547star

木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
3楼: Originally posted by xixi_pds7 at 2014-01-31 08:36:30
就是不用酶切点了？可以这样理解么，就是说，PCR的时候会产生很多片段，只有含有overlap同源臂的那一段才可以扩增？...

可以不用酶切位点，不用可能更好扩增。如果质粒都扩增出来很多带，可以通过优化或者胶回收来解决。扩增出来的片段两端是重组的overlap区。一般质粒可以用同一对引物，需要考虑overlap的是插入片段的引物。从你的帖子的消息看，个人建议你先做虚拟克隆，弄清楚了，再来设计引物进行PCR和Gibson Assembly。
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为什么
4楼2014-01-31 09:41:42
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xixi_pds7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 547star at 2014-01-31 09:41:42
可以不用酶切位点，不用可能更好扩增。如果质粒都扩增出来很多带，可以通过优化或者胶回收来解决。扩增出来的片段两端是重组的overlap区。一般质粒可以用同一对引物，需要考虑overlap的是插入片段的引物。从你的帖 ...

我的问题是前段，因为Gibson Assembly 是两条线性链的链接，我只是有点疑惑，怎么保证自己的质粒在需要的地方断开呢
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5楼2014-01-31 10:03:55
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
请问Gibson Assembly 一定要用蓝白筛选吗？可不可以不用蓝白筛选，直接挑克隆进行PCR筛选？这样效率能有多高？
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6楼2014-07-25 10:40:52
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)
★
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意思可能是用引物扩增质粒得到一条线性化的载体，然后扩pcr片段，重组
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7楼2015-09-10 19:42:22
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
意思就是从想要的酶切位点两端设引物扩质粒，得到线性化的载体
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8楼2016-03-07 00:43:58
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