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PCR问题 已有5人参与
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| 最近出现一些问题，PCR总是弥散的情况，也耗时一个月了。不知道给位是否出现过这样的现象，如果有希望能给予一些指导和帮助，不胜感激。鉴于所做的内容比较多，以附件的形式上传，希望大家能费心点开阅读，并群策群力。也看见小木虫上面有这样的现象出现，但是始终没有最终的总结过哪里出现了问题，我也想借这个机会，自己出现的问题进行总结，为以后的学弟学妹们做好总结，避免错误继续发生，令人抓狂。欢迎大家，踊跃讨论，最终解决问题。附件中，也许有表述不清的，请见谅。 |
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2014-01-03 10:13:55, 7.61 M
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gyesang: 回帖置顶 2014-01-04 00:30:47
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你的工作做的很全面，对问题的考虑也很全面；但是就PCR这样一个比较成熟的技术来讲，你的研究有些过于复杂化了。在我以前的实验室，PCR条带出现弥散一般都是很容易解决的。 先将我们以前的解决方法表述如下： 1.引物问题，这个一般是针对新合成的引物，对于已经成功做出实验的就不会过多考虑；如果新引物在一般条件没有获得很好的扩增（这个一般会用标准的质粒模板），通过梯度温度PCR仍然没有很好的扩增，那么就可以考虑重新设计引物。不过基于现在引物设计软件的强大功能，一般的引物不会出现问题，除非扩增的目的产物有很明显的特殊性。 2.样品问题，在引物没有问题的前提下，样品存在问题的可能性很高。作为模板的样品，在添加进PCR体系时很可能对整个的PCR体系产生影响；改变体系的PH，引入DNA酶的抑制物等等；一般建议PCR模板样品是直接用水溶解的，样品中不要含有太多的蛋白质杂质. 3.实验仪器和实验试剂的问题，这个两样一般不会出现问题，一台仪器要是有问题就把以前做的很好的样品作为对照就能解决啦；同理实验试剂也是的。 4.电泳问题，当然这个问题很好说明，直接看你的Maker条带是否清晰就行。 总结一下你的实验： 从你的实验数据看，你已经有过成功的实验，这样的话你仪器，试剂，电泳应该都是没有问题；主要的问题就是在的模板样品上面。 希望上面的分析对你的实验有帮助。 |
5楼2014-01-03 14:55:25
zhaolf
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4楼2014-01-03 13:45:35
7楼2014-01-03 15:50:46
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特别感谢您的解答，这是最靠谱和学术的一个。我先说明一下我的实验，由于最近一个月内出现这样的问题，本人稍显焦躁。上传了一个我的报告，也是我的一些拙见，您给一些建议，PCR其实主要只有三个主要部分构成：a 模板的制备 b PCR体系 c PCR程序 d 电泳体系 a,先说模板的制备：我也怀疑是模板的制备有问题，因为这个实验室是新建的，好多东西都可能存在不确定性，模板是最可能存在的问题，包括药品和仪器，这样我用试剂盒提取排除了一些因素。电泳，因为我做的白菜种子，样品很小，DNA含量虽不算很高，但是PCR足矣。排除了模板的问题。 b，PCR体系，PCR酶用的是全式金的，问过他们的销售最近没有市场上有酶问题的反应，我去别的实验室做过，一共两个，进行我的酶体系的实验，显示都没有问题。 c，PCR程序，我所采用的程序是之前很好的程序，所以很长时间我都没有将问题的重点放在这里面。始终觉得可能是引物出了毛病，我重新做的质谱，还有电泳，以及多家公司合成比较，发现问题并没有出现在这里。 d，电泳体系，我把别的实验室的DNA和引物用我们的酶体系以及电泳体系实验，效果很好，所以很多问题都排除了。 最近，我用相同的方法提取另一个白菜的品种的DNA，用另一对引物发现很好，平行实验很好。所以我才觉得可能在某种程度上说是PCR程序的问题。 我看也有很多在小木虫上面提问的，都出现这样的问题，但是最后都没有回答是怎样解决的，呵呵，所以很好奇，如果有出现这样情况的，聊一聊，对以后也有帮助，仅此而已。谢谢 |
9楼2014-01-03 16:12:19
yang0071
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