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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR问题
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常小晶

铁虫 (小有名气)

[求助] PCR问题 已有5人参与

最近出现一些问题，PCR总是弥散的情况，也耗时一个月了。不知道给位是否出现过这样的现象，如果有希望能给予一些指导和帮助，不胜感激。鉴于所做的内容比较多，以附件的形式上传，希望大家能费心点开阅读，并群策群力。也看见小木虫上面有这样的现象出现，但是始终没有最终的总结过哪里出现了问题，我也想借这个机会，自己出现的问题进行总结，为以后的学弟学妹们做好总结，避免错误继续发生，令人抓狂。欢迎大家，踊跃讨论，最终解决问题。附件中，也许有表述不清的，请见谅。
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  • 附件 1 : pure_test_--_problem.doc
    • 2014-01-03 10:13:55, 7.61 M

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1楼 2014-01-03 10:15:57
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+10, 鼓励交流！ 2014-01-04 00:30:24
gyesang: 回帖置顶 2014-01-04 00:30:47
你的工作做的很全面，对问题的考虑也很全面；但是就PCR这样一个比较成熟的技术来讲，你的研究有些过于复杂化了。在我以前的实验室，PCR条带出现弥散一般都是很容易解决的。
先将我们以前的解决方法表述如下：
1.引物问题，这个一般是针对新合成的引物，对于已经成功做出实验的就不会过多考虑；如果新引物在一般条件没有获得很好的扩增（这个一般会用标准的质粒模板），通过梯度温度PCR仍然没有很好的扩增，那么就可以考虑重新设计引物。不过基于现在引物设计软件的强大功能，一般的引物不会出现问题，除非扩增的目的产物有很明显的特殊性。
2.样品问题，在引物没有问题的前提下，样品存在问题的可能性很高。作为模板的样品，在添加进PCR体系时很可能对整个的PCR体系产生影响；改变体系的PH，引入DNA酶的抑制物等等；一般建议PCR模板样品是直接用水溶解的，样品中不要含有太多的蛋白质杂质.
3.实验仪器和实验试剂的问题，这个两样一般不会出现问题，一台仪器要是有问题就把以前做的很好的样品作为对照就能解决啦；同理实验试剂也是的。
4.电泳问题，当然这个问题很好说明，直接看你的Maker条带是否清晰就行。
总结一下你的实验：
从你的实验数据看，你已经有过成功的实验，这样的话你仪器，试剂，电泳应该都是没有问题；主要的问题就是在的模板样品上面。
希望上面的分析对你的实验有帮助。
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5楼2014-01-03 14:55:25
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zhaolf

木虫 (著名写手)

胖虎爱唱歌

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我的妈呀，我都不知道我为什么要下载，还仔细阅读了。同学，我很佩服你解决问题的意志力，我还很佩服你的勇气，敢用英文来写，而且，英文真的是差得有水平啊。唉，我不知道该咋说了，几乎每句话都有语法用词的错误。我要是认识你，真想把你揪过来一句话一句话给你改。
回到实验上来，我本人也是做了很多很多PCR的，有时候明明做的结果还不错，换了别的样品结果就很差，往往都是引物不太好引起的，或者引物工作条件比较苛刻，稍有不慎结果就很差。
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我是胖虎，我是孩子王！
4楼2014-01-03 13:45:35
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常小晶

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2014-01-03 11:10:24
你的老师呢？
师兄师姐呢？
这么长的，谁看的下去

那就不要看了！如果老师，兄长什么问题都能解决，要小木虫干什么
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7楼2014-01-03 15:50:46
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常小晶

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 大海一孤舟 at 2014-01-03 14:55:25
你的工作做的很全面，对问题的考虑也很全面；但是就PCR这样一个比较成熟的技术来讲，你的研究有些过于复杂化了。在我以前的实验室，PCR条带出现弥散一般都是很容易解决的。
先将我们以前的解决方法表述如下：
1.引 ...

特别感谢您的解答，这是最靠谱和学术的一个。我先说明一下我的实验，由于最近一个月内出现这样的问题，本人稍显焦躁。上传了一个我的报告，也是我的一些拙见，您给一些建议，PCR其实主要只有三个主要部分构成：a 模板的制备 b PCR体系 c PCR程序 d 电泳体系
a,先说模板的制备：我也怀疑是模板的制备有问题，因为这个实验室是新建的，好多东西都可能存在不确定性，模板是最可能存在的问题，包括药品和仪器，这样我用试剂盒提取排除了一些因素。电泳，因为我做的白菜种子，样品很小，DNA含量虽不算很高，但是PCR足矣。排除了模板的问题。
b，PCR体系，PCR酶用的是全式金的，问过他们的销售最近没有市场上有酶问题的反应，我去别的实验室做过，一共两个，进行我的酶体系的实验，显示都没有问题。
c，PCR程序，我所采用的程序是之前很好的程序，所以很长时间我都没有将问题的重点放在这里面。始终觉得可能是引物出了毛病，我重新做的质谱，还有电泳，以及多家公司合成比较，发现问题并没有出现在这里。
d，电泳体系，我把别的实验室的DNA和引物用我们的酶体系以及电泳体系实验，效果很好，所以很多问题都排除了。

最近，我用相同的方法提取另一个白菜的品种的DNA，用另一对引物发现很好，平行实验很好。所以我才觉得可能在某种程度上说是PCR程序的问题。
我看也有很多在小木虫上面提问的，都出现这样的问题，但是最后都没有回答是怎样解决的，呵呵，所以很好奇，如果有出现这样情况的，聊一聊，对以后也有帮助，仅此而已。谢谢
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9楼2014-01-03 16:12:19
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普通回帖

yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的老师呢？
师兄师姐呢？
这么长的，谁看的下去
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2楼2014-01-03 11:10:24
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
英文写的 不错  谢谢楼主了 楼主辛苦了
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生命不息奋斗不止
3楼2014-01-03 12:49:37
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常小晶

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaolf at 2014-01-03 13:45:35
我的妈呀，我都不知道我为什么要下载，还仔细阅读了。同学，我很佩服你解决问题的意志力，我还很佩服你的勇气，敢用英文来写，而且，英文真的是差得有水平啊。唉，我不知道该咋说了，几乎每句话都有语法用词的错误。 ...

我就是即兴写的，也是汇报用的，没有什么特别严谨的地方，请见谅。我用英文写也是无奈啊，凡是都是有个过程，相信您从下生来事就会说英文吧，呵呵。多谅解别人也是自己素养的体现，如果没有什么建设性的意见或者人云亦云就不要胡乱评论，自己难堪，也让别人讨厌。我也佩服我自己，而且我要一直写下去，谢谢。
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6楼2014-01-03 15:49:23
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常小晶

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2014-01-03 12:49:37
英文写的 不错  谢谢楼主了 楼主辛苦了

我也是没有办法，赶鸭子上架
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8楼2014-01-03 15:52:00
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常小晶

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaolf at 2014-01-03 13:45:35
我的妈呀，我都不知道我为什么要下载，还仔细阅读了。同学，我很佩服你解决问题的意志力，我还很佩服你的勇气，敢用英文来写，而且，英文真的是差得有水平啊。唉，我不知道该咋说了，几乎每句话都有语法用词的错误。 ...

请胖虎爱唱歌同志，以后但凡看见我的帖子千万不要回，因为我从小就喜欢哆啦A梦，我觉得只有哆啦A梦和大熊才是好伙伴。所以我从小就讨厌胖虎，如果刚才我的言辞过于激烈，请见谅，不是冲着您去的，是冲着胖虎去的，因为从小我就觉得胖虎是个自以为是的家伙！！
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10楼2014-01-03 16:24:26
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