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PCR问题 已有5人参与
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| 最近出现一些问题，PCR总是弥散的情况，也耗时一个月了。不知道给位是否出现过这样的现象，如果有希望能给予一些指导和帮助，不胜感激。鉴于所做的内容比较多，以附件的形式上传，希望大家能费心点开阅读，并群策群力。也看见小木虫上面有这样的现象出现，但是始终没有最终的总结过哪里出现了问题，我也想借这个机会，自己出现的问题进行总结，为以后的学弟学妹们做好总结，避免错误继续发生，令人抓狂。欢迎大家，踊跃讨论，最终解决问题。附件中，也许有表述不清的，请见谅。 |
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2014-01-03 10:13:55, 7.61 M
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4楼2014-01-03 13:45:35
【答案】应助回帖
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gyesang: 回帖置顶 2014-01-04 00:30:47
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gyesang: 回帖置顶 2014-01-04 00:30:47
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你的工作做的很全面，对问题的考虑也很全面；但是就PCR这样一个比较成熟的技术来讲，你的研究有些过于复杂化了。在我以前的实验室，PCR条带出现弥散一般都是很容易解决的。 先将我们以前的解决方法表述如下： 1.引物问题，这个一般是针对新合成的引物，对于已经成功做出实验的就不会过多考虑；如果新引物在一般条件没有获得很好的扩增（这个一般会用标准的质粒模板），通过梯度温度PCR仍然没有很好的扩增，那么就可以考虑重新设计引物。不过基于现在引物设计软件的强大功能，一般的引物不会出现问题，除非扩增的目的产物有很明显的特殊性。 2.样品问题，在引物没有问题的前提下，样品存在问题的可能性很高。作为模板的样品，在添加进PCR体系时很可能对整个的PCR体系产生影响；改变体系的PH，引入DNA酶的抑制物等等；一般建议PCR模板样品是直接用水溶解的，样品中不要含有太多的蛋白质杂质. 3.实验仪器和实验试剂的问题，这个两样一般不会出现问题，一台仪器要是有问题就把以前做的很好的样品作为对照就能解决啦；同理实验试剂也是的。 4.电泳问题，当然这个问题很好说明，直接看你的Maker条带是否清晰就行。 总结一下你的实验： 从你的实验数据看，你已经有过成功的实验，这样的话你仪器，试剂，电泳应该都是没有问题；主要的问题就是在的模板样品上面。 希望上面的分析对你的实验有帮助。 |
5楼2014-01-03 14:55:25
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