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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western boltting技术求救
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bb123456789

金虫 (正式写手)

[交流] western boltting技术求救

目前，本人正在做一个目标基因在各个发育时期和某一时期各个组织中的表达情况分析

在DNA水平，做TR-PCR验证在各个组织以及不同的发育时期均表达，但是做western blotting分析时，总没有目标带出来，用同样的抗体对纯化蛋白进行western blotting分析能出来目标带，不知道大家有没有遇到这样的问题？是怎么解决的呢？
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1楼 2013-12-19 23:05:12
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144528

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我不懂，可是我支持！我不懂，可是我支持！我不懂，可是我支持！我不懂，可是我支持！
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2楼2013-12-19 23:24:30
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jinwei331

至尊木虫 (文坛精英)
…………………………
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3楼2013-12-19 23:36:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
bb123456789: 金币+1 2013-12-20 09:44:45
目标蛋白的表达量低，可以增加上样量并减小一抗稀释倍数。
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4楼2013-12-20 01:49:55
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)
blessing
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6楼2013-12-20 07:58:31
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loveerobin

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
bb123456789: 金币+1 2013-12-20 09:45:05
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-20 12:28:58
目的蛋白的表达量低或者提取蛋白的纯度不高
一抗多的话，可以减少一抗的稀释倍数
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7楼2013-12-20 09:33:22
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bb123456789

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by loveerobin at 2013-12-20 09:33:22
目的蛋白的表达量低或者提取蛋白的纯度不高
一抗多的话，可以减少一抗的稀释倍数

目前总蛋白的上样量是100-150ug，一抗稀释按1:7500稀释的，二抗也是按这个比例稀释的  我们的PVDF膜孔径是0.45um，300mA湿转了一个半小时。会不会因为表达量低，转膜的时候转过了呢？
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8楼2013-12-20 09:50:13
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yaoxuexuezi

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一抗哪家的？这么高的稀释度？我们一般用CST的才1:1000稀释
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9楼2013-12-20 10:04:38
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15879003030

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
bb123456789: 金币+1 2013-12-20 12:14:32
可能是信号太低检测不到，  第一，你可以提高抗体浓度，，第二 你可以用高灵敏的显影液
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10楼2013-12-20 10:35:21
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loveerobin

木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
bb123456789: 金币+1, 做了的，纯化蛋白带能出来，纯化蛋白上样量差不多0.5ug，在相同曝光时间下带很明显 2013-12-20 12:16:36
引用回帖:
8楼: Originally posted by bb123456789 at 2013-12-20 09:50:13
目前总蛋白的上样量是100-150ug，一抗稀释按1:7500稀释的，二抗也是按这个比例稀释的  我们的PVDF膜孔径是0.45um，300mA湿转了一个半小时。会不会因为表达量低，转膜的时候转过了呢？...

有可能是表达量低，不大可能是转膜转过了
一抗稀释的有点厉害，如果一抗还多的话，减小一下稀释比例
下次做到时候，用纯化的目的蛋白点一个样，做对照
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11楼2013-12-20 11:15:24
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lidonghong

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
bb123456789: 金币+1 2013-12-20 12:18:18
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-20 12:29:15
做western blotting分析时，总没有目标带出来的时候，你有没有做纯化蛋白的一个阳性对照，如果做了且有阳性对照有条带，那就说明是你蛋白的问题，这样的原因大多可能是提取的问题（总蛋白浓度如何），也有可能你这个蛋白是一种丰度非常低的蛋白，wb非常难以检测也是有可能的。。。
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13楼2013-12-20 11:48:23
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bb123456789

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yaoxuexuezi at 2013-12-20 10:04:38
一抗哪家的？这么高的稀释度？我们一般用CST的才1:1000稀释

自己制备的一抗
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14楼2013-12-20 12:14:11
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bb123456789

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by lidonghong at 2013-12-20 11:48:23
做western blotting分析时，总没有目标带出来的时候，你有没有做纯化蛋白的一个阳性对照，如果做了且有阳性对照有条带，那就说明是你蛋白的问题，这样的原因大多可能是提取的问题（总蛋白浓度如何），也有可能你这个 ...

做了阳性对照，有条带出来   我们也考虑是目标蛋白丰度的问题，请问有什么方法可以改进呢？
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15楼2013-12-20 12:18:10
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loveerobin

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
bb123456789: 金币+2, 已经重提过了，效果还是不理想 目前有一些进展了，还在优化条件 2013-12-27 09:43:15
引用回帖:
8楼: Originally posted by bb123456789 at 2013-12-20 09:50:13
目前总蛋白的上样量是100-150ug，一抗稀释按1:7500稀释的，二抗也是按这个比例稀释的  我们的PVDF膜孔径是0.45um，300mA湿转了一个半小时。会不会因为表达量低，转膜的时候转过了呢？...

那就只能是提取蛋白的问题
最好是重提
最坏的可能就是表达量低
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16楼2013-12-20 14:00:12
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sjmr12215楼
2013-12-20 05:21   回复  
tang0612楼
2013-12-20 11:21   回复  
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